研究背景

造血干細胞（HSCs）的增殖異常會導(dǎo)致白血病、貧血、免疫缺陷等疾病的發(fā)生。通過促進HSCs增殖獲取足夠HSCs進行血液移植是治療血液系統(tǒng)疾�。ò籽�病等）的關(guān)鍵。已知細胞增殖與聚合酶II介導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)錄以及囊泡轉(zhuǎn)運有關(guān)，但RNA聚合酶II各個亞基的入核機制仍不清楚，且囊泡轉(zhuǎn)運驅(qū)動HSCs增殖的分子機理仍值得深入探究。

研究概述

2024年3月，中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院、西南大學(xué)李禮課題組和羅凌飛課題組在Nature Communications雜志上發(fā)表了題為“TANGO6 regulates cell proliferation via COPI vesicle-mediated RPB2 nuclear entry”的文章。該研究綜合利用細胞系以及小鼠等模型，揭示轉(zhuǎn)運和高爾基體組織—TANGO6通過外殼蛋白復(fù)合物I（COPI）囊泡轉(zhuǎn)運調(diào)控RNA聚合酶II亞基—RPB2入核驅(qū)動細胞增殖這一新機制，并強調(diào)了其在促進HSCs增殖中的重要作用。（麥特繪譜提供[2,3-13C2]標記的丙氨酸代謝流檢測技術(shù)）

技術(shù)路線圖

研究結(jié)果

1. TANGO6亞細胞定位和拓撲結(jié)構(gòu)鑒定

基于HeLa細胞探究COPI囊泡在整個細胞周期中的調(diào)節(jié)機制，發(fā)現(xiàn)高爾基體衍生的COPI囊泡是細胞質(zhì)中TANGO6的關(guān)鍵載體，并且在細胞周期進程中動態(tài)分布。隨后研究COPI囊泡轉(zhuǎn)運TANGO6的機制，借助不同數(shù)據(jù)庫分析TANGO6的氨基酸序列，預(yù)測了6個推定的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個信號錨點。進一步通過實驗證實TANGO6的N端以及C端均定位在細胞漿中，通過一個信號錨以及兩個跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在COPI囊泡上，從而隨著COPI囊泡運動。

免疫熒光染色圖像表明TANGO6 WT和TANGO6 KO細胞都含有丙氨酸。基于[2，3-13C2]標記丙氨酸的代謝流分析（麥特繪譜提供服務(wù)）結(jié)果顯示，丙氨酸水平在WT細胞沉淀中逐漸減少，在TANGO6 KO細胞沉淀中以更快速率下降，暗示TANGO6參與蛋白質(zhì)分泌。

圖1. COPI囊泡中TANGO6的拓撲結(jié)構(gòu)

2. TANGO6通過COPI-SNARE-ER通路進入細胞核

除了TANGO6在細胞質(zhì)中的動態(tài)分布外，在細胞核中也觀察到TANGO6信號。已知可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（SNARE）復(fù)合物介導(dǎo)的膜融合在貨物通過COPI囊泡從高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的逆向運輸中起著至關(guān)重要的作用，Co-IP結(jié)果表明，TANGO6與N-乙基馬來酰亞胺敏感融合蛋白（NSF，一種參與SNARE復(fù)合物介導(dǎo)膜融合的關(guān)鍵ATP酶）相互作用，提示COPI-SNARE-ER通路參與了TANGO6的入核。

Co-IP結(jié)果表明，TANGO6和富含亮氨酸的重復(fù)序列59（LRRC59）之間存在強大的相互作用。敲低KPNB1導(dǎo)致細胞核中TANGO6信號急劇減少，并伴隨TANGO6在細胞質(zhì)中的積累結(jié)合。結(jié)合siRNA干擾技術(shù)結(jié)果，最終明確TANGO6經(jīng)COPI囊泡轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，通過SNARE復(fù)合體介導(dǎo)的膜融合進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并在LRRC59和KPNB1的幫助下進入細胞核。

圖2. TANGO6的入核由SNARE復(fù)合體、ER和KPNB1輔助

3. TANGO6可攜帶RPB2到細胞核

TANGO6不與染色質(zhì)結(jié)合，推測其可能參與了各種因子向細胞核的轉(zhuǎn)運，因此對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U251進行質(zhì)譜分析以鑒定候選分子。結(jié)果表明，RNA聚合酶II復(fù)合物的第二大亞基—RPB2與TANGO6表現(xiàn)出實質(zhì)性的相互作用，隨后的Co-IP實驗證實了HeLa和U251細胞中TANGO6和RPB2之間的強相互作用。進一步，敲降TANGO6后發(fā)現(xiàn)RPB2累積在細胞漿中，無法入核。并隨后證實了TANGO6通過COPI囊泡介導(dǎo)的運輸將RPB2轉(zhuǎn)運到細胞核，并得到了來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的KPNB1的協(xié)助，整體表明TANGO6-RPB2軸在細胞增殖中起著不可或缺的作用。

圖3. TANGO6可攜帶RPB2到細胞核

4. TANGO6-RPB2軸在造血過程中被HSC廣泛使用

繼續(xù)探索TANGO6-RPB2軸在體內(nèi)的作用。建立傳統(tǒng)的Tango6敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠HSCs的產(chǎn)生不受影響，但在HSCs的增殖期（E12.5-E16.5）cKO小鼠通體變白，胎肝變小無血色。通過流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)HSCs的數(shù)量在突變體中顯著降低，且Tango6缺陷會影響小鼠HSCs中RPB2入核受阻，而過表達Tango6后HSCs數(shù)目增加，表明TANGO6-RPB2信號軸在生物體內(nèi)的重要功能之一是調(diào)控HSCs的增殖。

圖4. TANGO6-RPB2軸對小鼠造血干細胞在體內(nèi)的擴增至關(guān)重要

研究結(jié)論

本研究基于細胞系及小鼠等模型，以TANGO6為切入點，運用Co-IP、流式細胞術(shù)、同位素標記的代謝流等方法，揭示了RNA聚合酶II亞基的入核機制與TANGO6、RPB2和COPI囊泡轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的協(xié)同作用緊密協(xié)調(diào)有關(guān)。COPI囊泡相關(guān)的TANGO6通過逆行轉(zhuǎn)運將RPB2攜帶到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在LRRC59和輸入蛋白的幫助下攜帶到細胞核，以確保細胞增殖過程中的順利進展。此項研究為實現(xiàn)有效在體外擴增干細胞或并將其作為潛在治療靶點來緩解和治療腫瘤提供理論指導(dǎo)。

參考文獻

Feng Z, Liu S, Su M, et al. TANGO6 regulates cell proliferation via COPI vesicle-mediated RPB2 nuclear entry. Nature Communications. 2024.

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