InnoScan文獻(xiàn)快訊—
     DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力快速評(píng)估技術(shù) NEXT-SPOT      


       DNA 雙鏈斷裂 (DSB) 被認(rèn)為是最有害的 DNA 損傷類型，是突變和染色體畸變的有效誘導(dǎo)物，可能導(dǎo)致遺傳性疾病和癌癥。 為了維持基因組穩(wěn)定，人類細(xì)胞需要通過觸發(fā)高度復(fù)雜的分子反應(yīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)（以多種修復(fù)途徑為特征）來快速啟動(dòng)和調(diào)節(jié) DSB 修復(fù)。
       首先，非同源末端連接（NHEJ）途徑可在整個(gè)細(xì)胞周期中保持活躍，直接結(jié)合兩個(gè)斷裂末端，而不需要參考任何模板。 由于這些原因，它被認(rèn)為是所有類型 DSB 的主要修復(fù)機(jī)制。 相比之下，同源重組 (HR) 被認(rèn)為是無錯(cuò)誤的途徑，也是在細(xì)胞周期 G2/S 期（此時(shí)有模板材料可用）處理 DSB 的最佳選擇。 同源重組首先切除 DNA 末端，形成侵入同源 DNA 區(qū)域的單鏈區(qū)域。 然后，幾個(gè)競(jìng)爭(zhēng)途徑完成同源重組過程，并涉及 DNA 合成。 單鏈退火 (SSA) 有時(shí)被描述為同源重組的子途徑，因?yàn)樗�依賴于同源重組相關(guān)機(jī)制及其對(duì)同源性的依賴，它也涉及遺傳物質(zhì)的刪除，被認(rèn)為具有誘變性。
      當(dāng)非同源末端連接禁用時(shí)，另一種末端連接途徑（alt-EJ，也稱為微同源介導(dǎo)的末端連接）起作用。 它以一種容易出錯(cuò)的方式連接兩個(gè) DNA 末端，因?yàn)樗�通常意味著修�?fù)序列的微缺失。 不僅 HR，alt-EJ 和 SSA 都需要切除 DNA 末端以生成不同大小的單鏈 DNA (ssDNA) 尾部。 ssDNA 尾部的長(zhǎng)度影響修復(fù)機(jī)制的選擇， alt-EJ  2-20 bp，SSA 超過 50 bp，HR 大約 100 bp。 DNA 聚合酶在 DSB 修復(fù)中發(fā)揮重要作用，因?yàn)樗鼈兛梢蕴钛a(bǔ)空缺以促進(jìn) DNA 鏈連接或添加核苷酸以產(chǎn)生同源性。
      評(píng)估細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力對(duì)于了解疾病侵襲和治療反應(yīng)至關(guān)重要。傳統(tǒng)評(píng)估方法通常耗時(shí)且復(fù)雜。為解決該挑戰(zhàn)，研究人員開發(fā)了NEXT-SPOT技術(shù)。 NEXT-SPOT技術(shù)在DNA修復(fù)評(píng)估領(lǐng)域具有幾個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。它提供了一種快速而高效的DSB修復(fù)能力評(píng)估方法，使研究人員能夠在不到2小時(shí)內(nèi)獲得關(guān)于修復(fù)途徑的定性和定量信息。通過表征HR-like鏈侵入、DNA末端連接和合成活性，NEXT-SPOT提供了對(duì)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制的全面分析。該技術(shù)能夠檢測(cè)細(xì)胞在暴露于DNA損傷誘導(dǎo)劑和抑制劑后修復(fù)活性的變化，使其成為預(yù)測(cè)治療結(jié)果和指導(dǎo)個(gè)性化治療的寶貴工具。  
圖 1. 生物芯片上的 NEXT-SPOT 檢測(cè)原理概述。 每個(gè)生物芯片由14個(gè) 反應(yīng)區(qū)組成，每反應(yīng)區(qū)含兩種固定在芯片的底物，超螺旋質(zhì)粒（SC-質(zhì)粒）和線性質(zhì)粒（Lin-質(zhì)粒），每種底物各兩個(gè)點(diǎn)位。 修復(fù)反應(yīng)發(fā)生在固定底物和 Cy3 標(biāo)記的線性質(zhì)粒 (Cy3-Lin-plasmid)、生物素-dCTP 和添加的細(xì)胞裂解物之間。 然后，生物素標(biāo)記的 dCTP 通過 Cy5-鏈霉親和素顯示 或者使用 Cy5-dCTP 直標(biāo)。 使用InnoScan710AL 雙色激光熒光掃描儀（激發(fā)波長(zhǎng)：532 和 635 nm）對(duì)信號(hào)進(jìn)行量化。 SC-質(zhì)粒、Lin-質(zhì)粒、Syn-SC ：SC-質(zhì)粒上的DNA合成、Syn-Li：Lin-質(zhì)粒上的DNA合成。
 
NEXT-SPOT實(shí)驗(yàn)生物芯片制備過程包括以下步驟。
 
1.     制備超螺旋質(zhì)粒（SC-plasmid）和線性質(zhì)粒（Lin-plasmid）。
 
超螺旋 pBlueScript 質(zhì)粒（SC-質(zhì)粒；Stratagene）的制備如 Millau 等人所述（Millau, J.-F. et al. A microarray to measure repair of damaged plasmids by cell lysates. Lab Chip 8, 1713 (2008）。 線性質(zhì)粒（Lin-質(zhì)粒）是通過按照制造商方案（New England Biolabs）使用限制性內(nèi)切酶AflIII消化pBlueScript質(zhì)粒獲得。 用異丙醇/乙酸鈉沉淀 Lin-質(zhì)粒，并以所需濃度重懸于分子生物級(jí)水中。
Cy3 標(biāo)記的 線性質(zhì)粒 (Cy3-Lin-質(zhì)粒) 是使用 Label IT® Tracker™ 試劑盒 (Mirus) 按照供應(yīng)商的說明獲得。 簡(jiǎn)而言之，將 100 µg 線性質(zhì)粒與 50 µL Label IT® Reagent 和 100 µL 標(biāo)記緩沖液在 37 °C 下孵育 2 小時(shí)。 然后，Cy3-Lin-質(zhì)粒在乙醇/氯化鈉中沉淀，用分子生物級(jí)水稀釋并儲(chǔ)存在- 80°C。
使用 NanoDrop™ 分光光度計(jì)對(duì) Cy3-Lin-質(zhì)粒進(jìn)行定量； 標(biāo)記率是根據(jù)制造商的說明計(jì)算。 據(jù)估計(jì)，平均每 200 個(gè)堿基對(duì)約有一個(gè)標(biāo)簽。
 
2.     制作載玻片芯片：
 
使用生物芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)（SciFlexarrayer，Scienion 德國(guó)）將 SC-質(zhì)粒和 Lin-質(zhì)粒點(diǎn)制在涂層載玻片（Nexterion® H，Schott）特定位置。 形成 14 個(gè)相同反應(yīng)區(qū)，每個(gè)反應(yīng)區(qū)含 4 個(gè)未標(biāo)記質(zhì)粒的點(diǎn)（2 個(gè) SC 質(zhì)粒和 2 個(gè) Lin 質(zhì)粒）。 按照載玻片制造商描述的過程進(jìn)行質(zhì)粒固定和片基滅活。 將載玻片芯片真空 - 20 °C儲(chǔ)存。
 
 
3.     制備反應(yīng)室：
使用HybriWell™ Sealing System在生物芯片上形成14個(gè)相同的反應(yīng)室。
每個(gè)反應(yīng)室將用于進(jìn)行修復(fù)反應(yīng)，評(píng)估細(xì)胞裂解液中修復(fù)蛋白與固定質(zhì)粒的相互作用。
 
 
4.     修復(fù)反應(yīng)
使用 NEXT‑SPOT 進(jìn)行 DSB 修復(fù)分析。 HybriWell™ 密封系統(tǒng)（Grace Bio-Labs）應(yīng)用于載玻片芯片上，形成 14 個(gè)相同的反應(yīng)室。 每種裂解物均在 2 種不同的終蛋白質(zhì)濃度下進(jìn)行測(cè)試。 為此，混合物含有 (i) 2 ng/μL Cy3 標(biāo)記的線性 DSB 質(zhì)粒 (Cy3-Lin-plas-mid)、(ii) 0.25 µM 生物素-dCTP、0.25 µM 其他 3 種非標(biāo)記 dNTP , (iii) 80 mM KCl、20 mM Tris–HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、2 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、1 mM ATP、0.05 mg/mL 肌酸磷酸激酶、10 mM 磷酸肌酸，總反應(yīng)體積為 每孔 12 µL。 修復(fù)反應(yīng)在30℃下進(jìn)行1小時(shí)。 然后用 Milli-Q 水潤(rùn)洗載玻片兩次。 隨后通過與 0.1 µg/mL 鏈霉親和素-Cy5 溶液在 30 °C 下孵育 30 分鐘來標(biāo)記生物素-dCTP。 用 Milli-Q 水潤(rùn)洗載玻片兩次并干燥。 每個(gè)樣品在兩個(gè)反應(yīng)區(qū)進(jìn)行測(cè)試（技術(shù)重復(fù)）。 或者，使用 Cy5-dCTP 直接標(biāo)記，而不使用生物素-dCTP。
 
5.     信號(hào)檢測(cè)和分析
 
使用掃描儀（Innopsys 的 Innoscan 710AL 和 Mapix 軟件）以 532 nm (Cy3) 和 635 nm (Cy5)為激發(fā)光對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行量化。結(jié)果以 4 個(gè)重復(fù)的熒光強(qiáng)度平均值計(jì)算。每個(gè)樣品均由 4 個(gè)值表征，分別為 HR 樣鏈侵入、NHEJ 介導(dǎo)的末端連接、SC 質(zhì)粒上的 DNA 合成 (Syn-SC) 和 Lin 質(zhì)粒上的 DNA 合成 (Syn-Lin)。
 

      NEXT-SPOT技術(shù)代表了DNA修復(fù)能力評(píng)估領(lǐng)域的重大進(jìn)展。通過將創(chuàng)新的生物芯片技術(shù)與激光熒光掃描相結(jié)合，NEXT-SPOT提供了一種快速、可靠和全面的方法，用于評(píng)估DSB修復(fù)途徑。該技術(shù)提供詳細(xì)的細(xì)胞修復(fù)機(jī)制見解，有望促進(jìn)個(gè)性化醫(yī)學(xué)，并在腫瘤學(xué)領(lǐng)域和其他領(lǐng)域改善患者預(yù)后。
 

文獻(xiàn)原文鏈接： https://doi.org/10.1038/s41598-022-23819-0