活細胞的“聚光燈”——前沿活細胞成像的案例分享

細胞是一切生命的基本單位，構(gòu)成了各式各樣的生命體。因此研究細胞的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部生命活動過程可以幫助我們更深入地探究生命的奧秘，了解生命體是如何構(gòu)建和運作的。傳統(tǒng)的細胞顯微術(shù)只能通過觀察固定的細胞標本進行推測，但已經(jīng)失“活”的細胞已經(jīng)無法反應(yīng)新陳代謝、信號傳導等生命活動，無法反應(yīng)活細胞的真實情況。因此活細胞顯微術(shù)越來越受到生命科學研究學者的青睞，能夠在細胞仍然活躍并處于正常生理活動的狀態(tài)下進行觀察，幫助科學家更好地研究細胞間的相互作用，以及進行藥物研發(fā)和篩選等方面的應(yīng)用。在這里，我們整理了近幾年來自Lumencor的白光光源運用于活細胞顯微術(shù)的前沿研究，希望能為您的研究帶來靈感。

細胞內(nèi)部Ca2+，線粒體膜電位和細胞質(zhì)乳酸的延時成像

來自威斯康星大學麥迪遜分校Sophia M. Sdao, Thuong Ho, Chetan Poudel等科學家研究了CDK2和β活細胞之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CDK2可以抑制β活細胞的氧化糖代謝和胰島素分泌，同時對β細胞的代謝信號和K(ATP)通道有重要影響。作者利用一個可誘導的β細胞特異性CDK2缺失的小鼠模型(CDK2-IKO)進行研究，發(fā)現(xiàn)這種小鼠的葡萄糖耐受性和葡萄糖刺激的胰島素分泌都有所提高。實驗中通過多種方法測量了CDK2-IKO小鼠的β細胞電活性、鈣信號、NAD(P)H熒光壽命、乳酸水平和線粒體膜電位。在搭建延時成像生物傳感器時，采用Lumencor SOLA SEII 365作為熒光激發(fā)光源，并且基于Lumencor精確的電子控制系統(tǒng)，可以快速調(diào)節(jié)光輸出的強度，設(shè)置為<20%的功率輸出。

參考文獻

Sdao S M , Ho T , Poudel C ,et al.CDK2 limits the highly energetic secretory program of mature β cells by restricting PEP cycle-dependent KATP channel closure[J].Cell Reports, 2021, 34(4):108690.DOI:10.1016/j.celrep.2021.108690.

HuH-7人肝癌細胞中GFP表達的20小時延時成像

非病毒基因遞送是基因治療領(lǐng)域的一個快速發(fā)展的研究課題，其低免疫原性避免了免疫系統(tǒng)對外源基因的排斥和攻擊，提高了基因治療的安全性和有效性，但受到合成核酸納米載體在內(nèi)吞體內(nèi)停留時間的限制。為了克服這種瓶頸，需要一種能夠同時測量納米載體的攝取動力學和轉(zhuǎn)染效率的方法。慕尼黑大學的研究人員A. Reiser, D. Woschée, N. Mehrotra等人使用單細胞陣列的活細胞成像(LISCA)來研究不同血清條件下基于脂質(zhì)mRNA復(fù)合物的遞送時間分布，文中使用HuH-7肝癌細胞作為系統(tǒng)模型（RNA治療的主要靶器官之一）。該方法可以同時監(jiān)測數(shù)百個單細胞的eGFP報告基因表達，通過擬合到模型，即可得到每個單細胞的表達起始時間和表達速率等參數(shù)。本文采用微結(jié)構(gòu)單細胞陣列和自動活細胞延時顯微鏡來收集單個熒光時間過程。其中用于延時成像的時間分辨熒光顯微鏡搭載的即是來自Lumencor的SOLA-SE II LED光源。

參考文獻

Reiser A ,D Woschée, Mehrotra N ,et al.Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection[J].Integrative Biology, 2019, 11(9).DOI:10.1093/intbio/zyz030.

用高通量多色熒光顯微鏡觀察單個大腸桿菌細胞雙鏈斷裂修復(fù)

來自瑞典烏普薩拉大學和皇家理工學院的研究人員Wiktor J, Gynnå A H, Leroy P等在Nature上發(fā)表了一篇探索活細菌中RecA螺旋絲如何通過同源重組修復(fù)雙鏈DNA斷裂（DSB）機制的文章。在一個可誘導的DSB系統(tǒng)中，利用高通量、微流控和熒光顯微技術(shù)，直接觀察大腸桿菌中DSB修復(fù)的過程，以及RecA蛋白在修復(fù)中的動態(tài)變化，如下圖中所展示的。

在搭建實驗所用的熒光顯微鏡時，Lumencor的Spectra III 系列的熒光光源與Nikon的Ti2-E倒置顯微鏡以及Andor的Sona 4.2B-11 scmos相機組合使用。顯微鏡由運行內(nèi)建插件Micro-Manager控制。而熒光光源由相機通過TTL連接觸發(fā)，使用電子快門控制。Lumencor的TTL觸發(fā)輸入可以外部控制集成的八個光源的選擇以及開關(guān)，憑借精確的電子控制，切換速度間隔可達10μs。

參考文獻

Wiktor J, Gynnå A H, Leroy P, et al. RecA finds homologous DNA by reduced dimensionality search[J]. Nature, 2021, 597(7876): 426-429.

基因編碼電壓指示劑 （GEVI） JEDI-1P 在解離的大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元中的成像

使用基因編碼的電壓指示劑（GEVI）進行寬場成像是了解大型皮層網(wǎng)絡(luò)在神經(jīng)編碼行為中的作用的一種有前景的方法。萊斯大學以及埃默里大學的研究人員開發(fā)了一種針對單光子成像優(yōu)化的GEVI和改進的方法，應(yīng)用于小鼠長期的全腦電壓成像。并通過一個自動化高通量篩選平臺，使其具有快速的動力學、高亮度、高靈敏度和在寬常單光子照明下的高光穩(wěn)定性。在多輪定向進化后，產(chǎn)生了在所有指標上都有所提高的JEDI-1P，這是一種綠色的熒光指示劑，zui終研究人員成功在清醒小鼠中實現(xiàn)了穩(wěn)定的全腦電壓成像。

為了以高通量的方式評估GEVI的性能，研究人員搭建了一個基于倒置顯微鏡（A1R-MP,Nikon Instruments）自動化多模式的96孔篩選平臺。由Lumencor的LED光引擎（SpectraX）產(chǎn)生激發(fā)光，通過液態(tài)光波導（LLG）引導至顯微鏡的熒光頂置照明器。其中青色光(中心波長/帶寬，470/24nm)和綠光(550/15nm)通過物鏡分別照射到樣品臺上，激發(fā)基于GFP的GEVI以及mCherry。

參考文獻

Lu X, Wang Y, Liu Z, et al. Widefield imaging of rapid pan-cortical voltage dynamics with an indicator evolved for one-photon microscopy[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 6423.

Fura-2 Ca2+在小鼠垂體細胞中的成像

為了探究蛋白酪氨酸磷酸酶受體N和N2（PTPRN和PTPRN2）在小鼠繁殖過程中的性別特異性作用機制，美國國立衛(wèi)生研究院的尤尼斯肯尼迪施萊佛guo家兒童健康與人類發(fā)展研究所 (Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development)的研究人員對PTPRN和PTPRN2進行雙敲除（DKO）,結(jié)果導致雌性小鼠不育，表現(xiàn)出青春期延遲、無排卵、卵巢基因表達和類固醇合成的改變。而雄性小鼠則大部分育性不受影響，睪丸的基因表達、類固醇合成以及生殖器官的發(fā)育沒有明顯影響。在研究過程中，鈣離子成像技術(shù)被用于研究垂體細胞的成像，研究PTPRN和PTPRN2的缺失對垂體促性腺激素細胞（gonadotrophs GnRH）的鈣信號的影響。340/30nm和380/20 nm的激發(fā)帶通由Retra II光引擎（Lumencor,Beaverton,OR）提供，激發(fā)帶通通過510/84nm的濾光片進行了檢測。

圖中展示了一些GnRH（100pM）誘導培養(yǎng)垂體細胞中的鈣信號數(shù)據(jù)。實驗使用源自WT和DKO雄性和雌性小鼠的細胞進行。

參考文獻

Sokanovic S J , Constantin S , Dams A L ,et al.Common and female-specific roles of protein tyrosine phosphatase receptors N and N2 in mice reproduction[J].Scientific Reports[2024-01-15].DOI:10.1038/s41598-023-27497-4.

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