Fluid shear stress induced-endothelial phenotypic transition contributes to cerebral ischemia-reperfusion injury and repair

Topics：Cytoskeleton, Endothelium, Cell biology, Cytoplasm, Inflammation, Biomechanics, Cell biophysics, Blood brain barrier, Cardiovascular system

 缺血性腦卒中是全球主要死亡原因之一，主要的臨床治療方法包括藥物溶栓和血栓切除術(shù)。然而，這些手術(shù)后的快速再灌注可能會損害腦功能并惡化卒中的預(yù)后，從而導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷（IRI）。缺血性卒中導(dǎo)致腦血流量減少，使內(nèi)皮細(xì)胞暴露于相對較低的剪切應(yīng)力（LSS）中。有趣的是，再灌注治療可恢復(fù)生理流體剪切應(yīng)力（PFSS），但也增加了更嚴(yán)重的再灌注損傷的風(fēng)險。然而，F(xiàn)SS在再灌注損傷和修復(fù)中調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能的機(jī)制仍然難以捉摸。

許多外部生化和生物物理刺激，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β （TGF-β） 和機(jī)械應(yīng)力，都可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）的發(fā)生。與 EndMT 相反，間充質(zhì)-內(nèi)皮轉(zhuǎn)化（MEndT）通過上調(diào)內(nèi)皮相關(guān)標(biāo)志物來恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的特性和功能。盡管先前的研究已經(jīng)證明了 EndMT 對動脈粥樣硬化病變和斑塊不穩(wěn)定的貢獻(xiàn)，F(xiàn)SS 誘導(dǎo)的 EndMT 對腦 IRI 的影響尚未完全闡明。內(nèi)皮炎癥與EndMT的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，炎癥是再灌注損傷的普遍病理特征，在繼發(fā)性腦損傷中起重要作用。然而，在再灌注治療后，由于局部生理血流的恢復(fù)，缺血性腦組織發(fā)生了更嚴(yán)重的炎癥損傷反應(yīng)，這種炎癥性損傷的加重與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)。因此，需要進(jìn)一步探索腦缺血-再灌注損傷和修復(fù)過程中內(nèi)皮炎癥與 EndMT 之間的關(guān)系。

作為眾所周知的機(jī)械傳感器，Yes相關(guān)蛋白（YAP）和具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）對機(jī)械刺激做出反應(yīng)并易位到細(xì)胞核中以啟動基因轉(zhuǎn)錄。研究表明，F(xiàn)SS誘導(dǎo)YAP從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的易位，促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），并增強(qiáng)肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。也有研究表明，血流依賴性 YAP/TAZ 活性調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的內(nèi)皮表型，且YAP作為機(jī)械反應(yīng)分子調(diào)節(jié)內(nèi)皮炎癥。然而，在腦缺血再灌注損傷和修復(fù)期間尚不清楚 YAP 是否在調(diào)節(jié) EndMT 和內(nèi)皮炎癥反應(yīng)中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用。

最近，在四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室課題人員的一項(xiàng)工作中，構(gòu)建了大腦中動脈栓塞體內(nèi)模型（MCAO）和體外平行平板流室模型，以探討FSS對IRI過程中內(nèi)皮表型轉(zhuǎn)化和炎癥的影響，同時，利用mRNA測序技術(shù)檢測了觸發(fā)YAP激活的細(xì)胞骨架相關(guān)信號通路。研究結(jié)果為IRI的治療提供了新的視角。研究成果發(fā)表在 APL Bioengineering 期刊題為“Fluid shear stress induced-endothelial phenotypic transition contributes to cerebral ischemia-reperfusion injury and repair”。

首先，將大鼠隨機(jī)分為4組，包括Sham（假手術(shù)組）、IS（缺血2h）、IS/RE（缺血2h + 再灌注1d）和IS/RL（缺血2h + 再灌注30d），檢測了早期和晚期再灌注期間的內(nèi)皮炎癥，發(fā)現(xiàn)早期再灌注時的炎癥明顯加重，但隨著再灌注時間的延長而緩解。通過觀察再灌注各階段中EB熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在再灌注早期，炎癥的加重使血腦屏障（BBB）通透性增加。并進(jìn)一步觀察到BBB的緊密連接，且隨著再灌注時間的延長，BBB 的功能逐漸恢復(fù)。

為了在體外研究FSS與IRI的關(guān)系，將大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rBMECs）暴露于0.5 dyn/cm2 LSS 6h（LSS 組），然后將 FSS 增加到生理水平2 dyn/cm2分別持續(xù)2h（LSS/EP 組）和 12h（LSS/LP 組）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NF-ĸB P65在早期缺血再灌注階段（LSS/EP組）從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，這意味著內(nèi)皮炎癥明顯加重（圖1 a）。值得注意的是，在 LSS 和 LSS/LP 組中，NF-ĸB P65 的定位于細(xì)胞質(zhì)。此外，LSS/EP組TLR4、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TNF-α和NF-ĸB等炎癥相關(guān)因子的mRNA表達(dá)均高于LSS組和LSS/LP組（圖1 b、c）。與LSS/EP組相比，這些因子在LSS/LP組表達(dá)降低，提示內(nèi)皮炎癥隨著再灌注時間的延長而減輕（圖1 b、c）。上述結(jié)果表明，缺血再灌注的早期階段（暴露于FSS，0.5-2 dyn/cm2）誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)加重，隨著再灌注時間的延長，rBMECs緩解了炎癥反應(yīng)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)皮炎癥誘導(dǎo)的BBB功能障礙，通過TEM檢查了緊密連接（TJs）的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)LSS組加載6h的條件下，在相鄰的rBMECs中找到分離的TJs結(jié)構(gòu)。特別是，當(dāng)rBMECs暴露于2 dyn/cm2 FSS 2h時，LSS/EP組中TJs的結(jié)構(gòu)在某些區(qū)域變得不規(guī)則、分離甚至丟失。此外，還檢測了每組 rBMECs 中 TJs 相關(guān)蛋白 Claudin 5、Occludin 和 ZO-1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與LSS組相比，LSS/EP組的表達(dá)水平顯著降低，表明炎癥加重誘導(dǎo)了TJs丟失，但在 LSS/LP 組中上調(diào)，表明在12h生理 FSS 條件下炎癥緩解，內(nèi)皮屏障恢復(fù)。

這些發(fā)現(xiàn)表明，在再灌注的早期階段，通過下調(diào)TJ相關(guān)蛋白，增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致血腦屏障和內(nèi)皮功能障礙。細(xì)胞逐漸適應(yīng)連續(xù)的生理FSS，并恢復(fù)內(nèi)皮表型和功能。

圖1 FSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥和血腦屏障功能障礙。

接下來，為了探究FSS調(diào)控IRI炎癥的分子機(jī)制，對暴露于FSS的rBMECs進(jìn)行了第二代mRNA測序。結(jié)果顯示，與LSS組相比，LSS/EP組的內(nèi)皮標(biāo)志基因表達(dá)顯著下調(diào)，而間充質(zhì)標(biāo)志基因和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。然而，與LSS/EP組相比，LSS/LP組間充質(zhì)標(biāo)志基因和炎癥相關(guān)基因顯著下調(diào)，而內(nèi)皮標(biāo)志基因顯著上調(diào)。

KEGG分析表明，顯著表達(dá)的差異基因涉及的主要信號通路為肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、黏著斑、緊密連接、PI3K-Akt信號通路等，特別是肌動蛋白細(xì)胞骨架通路對IRI的貢獻(xiàn)最顯著。

根據(jù)mRNA測序結(jié)果，進(jìn)一步探討了IRI和修復(fù)的機(jī)制。研究人員假設(shè)內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮和間充質(zhì)表型之間的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致了再灌注過程中的炎癥。一方面，與體內(nèi)IS組相比，IS/RE組間充質(zhì)標(biāo)志物明顯上調(diào)，表明EndMT發(fā)生在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中。然而，這些間充質(zhì)標(biāo)志物在 IS/RL 組中顯著降低，表明腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)生了逆轉(zhuǎn)的 MEndT 事件（圖2 a）。另一方面，LSS/EP 組的 VE-鈣粘蛋白（內(nèi)皮標(biāo)志物）從細(xì)胞膜易位到細(xì)胞質(zhì)（圖2 d），其表達(dá)水平也顯著下調(diào)（圖2 e），而間充質(zhì)標(biāo)志物水平顯著升高（圖2 b、c）。這些結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明在暴露于0.5-2 dyn/cm2 FSS的rBMECs中觸發(fā)了EndMT過程。有趣的是，隨著2 dyn/cm2的FSS從2h增加到12 h，LSS/LP組VE-鈣粘蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（圖2 e），而間充質(zhì)標(biāo)志物水平顯著下降（圖2 b、c）。

這些結(jié)果表明，F(xiàn)SS水平的降低觸發(fā)了rBMECs的EndMT過程，而恢復(fù)的FSS則以時間依賴性的方式導(dǎo)致了逆轉(zhuǎn)的MEndT事件。

圖2 連續(xù)改變FSS誘導(dǎo)rBMEC 表型轉(zhuǎn)化。

最后，實(shí)驗(yàn)討論了FSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷EndMT和炎癥的潛在生物力學(xué)機(jī)制。在大鼠MCAO模型中發(fā)現(xiàn)YAP在IS/RE組中高表達(dá)并易位到細(xì)胞核。然后，通過敲低 YAP 檢測 EndMT 標(biāo)志物的表達(dá)來驗(yàn)證 YAP 在腦 IRI 期間 EndMT 和炎癥中的作用。與圖2的結(jié)果相反，F(xiàn)SS-shYAP 消除了由 VE-鈣粘蛋白上調(diào)和 N-鈣粘蛋白下調(diào)所指示的這些間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，表明 FSS-shYAP rBMECs 維持了內(nèi)皮表型（圖3 a-c）。據(jù)報(bào)道，MMP-2 表達(dá)的增加通常與 EMT 的誘導(dǎo)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，YAP敲低后，所有組的MMP2表達(dá)沒有變化。此外，與LSS相比，暴露于PFSS的sh-rBMECs中間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)上調(diào)，但PFSS/EP組與PFSS/LP組間無顯著差異。同時，炎癥因子TNF-α的表達(dá)在LSS、LSS/EP和LSS/LP組均無顯著變化（圖3 d-f）。這些結(jié)果證實(shí)了YAP參與調(diào)節(jié)EndMT，與腦缺血灌注損傷和修復(fù)過程密切相關(guān)。

已知肌動蛋白細(xì)胞骨架通路對IRI的貢獻(xiàn)最為顯著。機(jī)械線索調(diào)節(jié) Rho GTPases 的活性，進(jìn)而導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架重塑。與靜態(tài)對照組相比，LSS組的RhoA、Cdc42和 Rac1 表達(dá)顯著上調(diào)，在LSS/EP階段顯著下調(diào)，表明 Rho GTPases 響應(yīng) FSS 并可能調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑。

此外，還探討了肌動蛋白在YAP激活中的作用。發(fā)現(xiàn)FSS誘導(dǎo)F-肌動蛋白纖維的重塑和重排，但可以被細(xì)胞骨架抑制劑Lat B顯著抑制。Lat B處理后，LSS/EP期內(nèi)皮標(biāo)志物表達(dá)顯著上調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)顯著下調(diào)。所有組中炎癥因子TNF-α的表達(dá)均無顯著差異。這表明細(xì)胞骨架的抑制導(dǎo)致 rBMECs恢復(fù)內(nèi)皮表型并減輕炎癥。

這些發(fā)現(xiàn)表明，YAP通過Rho GTPases-F-actin信號通路介導(dǎo)腦IRI中的EndMT。

圖3 YAP 介導(dǎo)的 FSS 調(diào)節(jié)腦 IRI 中的 EndMT。

圖4 FSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮表型轉(zhuǎn)化導(dǎo)致內(nèi)皮炎癥促進(jìn)缺血再灌注損傷和修復(fù)的示意圖。

（a）在早期再灌注時，恢復(fù)的血流供應(yīng)（剪切應(yīng)力強(qiáng)度增加）在 ECs 中誘導(dǎo) EndMT，導(dǎo)致炎癥和血管損傷加重。在晚期再灌注時，ECs逐漸適應(yīng)生理剪切水平（剪切應(yīng)力持續(xù)時間增加），恢復(fù)內(nèi)皮表型（MEndT），并減輕內(nèi)皮炎癥。（b）FSS 的暴露強(qiáng)度和持續(xù)時間不斷變化，ECs 經(jīng)歷了內(nèi)皮間充質(zhì)表型（從 EndMT 到 MEndT），該表型依賴于 Rho GTPases——F-actin 來調(diào)節(jié) YAP 的激活。

綜上所述，該研究證明了 FSS 在早期再灌注時從 LSS 轉(zhuǎn)變?yōu)?PFSS，通過調(diào)節(jié) rBMECs 中的 EndMT 轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)炎癥損傷和腦損傷。然而，隨著再灌注時間的增加，內(nèi)皮細(xì)胞逐漸適應(yīng)PFSS并經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)的MEndT，從而恢復(fù)其內(nèi)皮表型，并緩解晚期再灌注期間的內(nèi)皮炎癥和腦損傷。這項(xiàng)研究為針對IRI的治療策略提供了寶貴的見解。

參考文獻(xiàn)：Sun D, Ma J, Du L, Liu Q, Yue H, Peng C, Chen H, Wang G, Liu X, Shen Y. Fluid shear stress induced-endothelial phenotypic transition contributes to cerebral ischemia-reperfusion injury and repair. APL Bioeng. 2024 Feb 26;8(1):016110. doi: 10.1063/5.0174825. PMID: 38414635; PMCID: PMC10898918.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38414635/

Impact Factor 6.0

Online ISSN 2473-2877

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