掃描電鏡制樣之5種常用的生物樣品干燥方法的介紹
生物樣品含水直接觀察，會對掃描電鏡造成以下影響：
1. 樣品蒸發(fā)的水蒸氣遭遇高能電子束，會被電離而放電，引起束流大幅度波動，使圖像模糊，或者根本不能成像;
2. 大多數(shù)含水樣品在高真空中容易發(fā)生形態(tài)損傷，表面皺縮、變形;
3. 樣品揮發(fā)會造成鏡頭、光闌等的污染;
4. 燈絲會被上升水蒸氣氧化而變質(zhì)。
生物樣品的含水量高，二次電子產(chǎn)率低，導(dǎo)電性差，對熱，電子束敏感，僅有少數(shù)樣品如毛發(fā)、牙齒以及含水量極低的昆蟲等可以直接噴鍍觀察，絕大多數(shù)的生物樣品均要求經(jīng)過干燥處理才能鍍金觀察。
干燥是掃描電鏡生物樣品制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如果處理不好，會直接影響到觀察的清晰度與準確度。要想制備出好的掃描電鏡生物樣品，需要在干燥過程中盡可能減少由于水分蒸發(fā)而引起的樣品表面形貌的形變，且必須確保干燥徹底。大多數(shù)動植物容易發(fā)生明顯的塌陷和變形。因此，需要針對不同的生物樣品來選擇合適的干燥方法。
掃描電鏡生物樣品制備常用干燥方法
01 自然干燥法
自然干燥法是指樣品中的水分在大氣中自然蒸發(fā)，或樣品經(jīng)脫水處理后脫水劑自然揮發(fā)而干燥的方法。
對干種子、果殼、某些干花粉、昆蟲標本等來說，自然干燥法是一個簡易實用有效的方法，雖然在自然干燥過程中，樣品體積有所收縮，但卻保留了樣品的基本形態(tài)。適用于外表堅硬的樣品，如外表有殼的昆蟲，木材等。
自然風(fēng)干——飛納掃描電鏡直接觀察螨蟲
02 烘干干燥法
烘干干燥法是將要研究的樣品用烘干箱烘干，一般溫度控制在 80℃ 以下，烘干程度以含水量在 5% 以下為好。此方法的干燥速度較快，但水分蒸發(fā)時可能造成樣品變形或斷裂。適用于不易變形且耐熱的樣品，比如淀粉粒、孢子粉等。
烘干的花粉噴金后直接可以用二次電子觀察
03 臨界點干燥法
臨界點干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下，液體和氣體的密度相等，氣液界面完全消失，液體的表面張力系數(shù)為零。臨界點干燥法之所以一直被視為制作生物醫(yī)學(xué)掃描樣品最可靠的干燥方法，是因為此法能消除液體表面張力的作用，干燥出的樣品能較大程度地保存其自然形態(tài)。
04 冷凍干燥法
冷凍干燥法是將含水樣品放入低溫環(huán)境中冷凍，或使用溶劑將樣品中的水逐級替換后冷凍，然后抽真空升華。它是利用低溫和真空，使樣品中的水分或溶劑直接升華，以達到干燥樣品的目的。冷凍干燥過程不經(jīng)過液相階段，因而避免了氣相和液相之間表面張力對樣品的損傷。
05 真空干燥法
真空干燥法指的是將經(jīng)脫水（多用梯度脫水）的樣品置于真空容器中進行干燥的方法。真空干燥法選用高熔點的有機溶劑（叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷、正丁醇等）作升華介質(zhì)，既保留了冷凍干燥法的優(yōu)點，又不用對樣品進行冷凍處理，無冷凍損傷，且操作簡單。適用于所有生物樣品，特別是細菌、細胞等微小樣品。
經(jīng)過梯度脫水真空干燥的桿菌可以輕松獲得高倍圖像
小結(jié)
干燥方法在不斷改進，但還是只能把由干燥引起的樣品變形控制在一定的范圍內(nèi)。上述 5 種干燥方法各有優(yōu)缺點，且各有適用的生物樣品種類。我們在選擇生物樣品干燥的方法時，盡量選擇能保持樣品表面真實結(jié)構(gòu)的方法，在保證掃描電鏡狀態(tài)下，盡量還原樣品表面細節(jié)。
對于生物樣品，飛納電鏡低真空模式可以直接觀察一些生物樣品，如新鮮植物葉片，昆蟲等。觀察葉子氣孔，高亮度的 CeB6 燈絲可以在低曝光時間下快速拍照，獲得高質(zhì)量圖像，避免了長時間曝光導(dǎo)致氣孔關(guān)閉以及長時間抽真空導(dǎo)致葉片失水收縮。
飛納電鏡低真空下觀察葉子氣孔
此外，飛納電鏡的專用控溫樣品杯可以控制樣品溫度，進而改變樣品周圍的濕度，最大限度地降低電子束和真空度對樣品的損壞。適用于一些含水較高的水凝膠，蛋白，藻類等樣品，在冷凍狀態(tài)下，不脫水，背散射直接觀察，可以保持樣品的原始形貌結(jié)構(gòu)。
冷凍的水凝膠，觀察到其大范圍內(nèi)，短程有序，長程無序
