期刊：Nature Communications
影響因子：16.6
主要技術(shù)： ScRNA-seq、ST

導(dǎo)語

腫瘤微環(huán)境的空間組織對生物學(xué)和治療反應(yīng)有著深遠(yuǎn)的影響。對hpv陰性口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)進(jìn)行了單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以全面表征腫瘤核心(TC)和前沿(LE)轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)中的惡性細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)TC和LE具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄譜，鄰近的細(xì)胞組成和配體-受體相互作用的特征。證明了與LE相關(guān)的基因表達(dá)譜在不同的癌癥中是保守的，而TC是組織特異性的，突出了腫瘤進(jìn)展和侵襲的共同機(jī)制。此外，發(fā)現(xiàn)LE基因標(biāo)記與較差的臨床結(jié)果相關(guān)，而TC基因標(biāo)記與多種癌癥類型的預(yù)后改善相關(guān)。最后，使用計(jì)算機(jī)建模方法，描述了OSCC中可預(yù)測的與藥物反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞發(fā)育的空間調(diào)節(jié)模式。作者的工作提供了對TC和LE生物學(xué)和交互式空間地圖集的泛癌癥見解(http://www.pboselab.ca/spatial_ OSCC/;http://www.pboselab.ca/dynamo_OSCC/)，這可以為開發(fā)新的靶向治療奠定基礎(chǔ)。

主要技術(shù)
ScRNA-seq、ST

研究結(jié)果
1. OSCC樣本的ST譜分析和細(xì)胞反褶積
使用10x Genomics Visium平臺對來自10例獨(dú)特患者的12個(gè)新鮮冷凍的手術(shù)切除的OSCC樣本進(jìn)行了ST檢測。從24876個(gè)點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組被測序到每個(gè)點(diǎn)43648個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化后的平均reads。對每個(gè)腫瘤樣本的蘇木精和伊紅（H&E）染色圖像進(jìn)行了檢查，并對形態(tài)學(xué)區(qū)域進(jìn)行了注釋。通過對單獨(dú)的、公開的HNSCC scRNA-seq數(shù)據(jù)集的ST數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，確定了病理注釋的鱗狀細(xì)胞癌區(qū)域中存在的惡性腫瘤細(xì)胞和其他細(xì)胞亞群的組成。為了識別惡性腫瘤斑點(diǎn)，嚴(yán)格地描述惡性細(xì)胞為反褶積評分>0.99，或CNV概率評分>0.99。CNV分析顯示3號染色體反復(fù)缺失，9號染色體出現(xiàn)擴(kuò)增。經(jīng)過對分類的細(xì)胞進(jìn)行批效應(yīng)校正和降維后，ST反映了轉(zhuǎn)錄譜的連續(xù)體。空間反褶積分析顯示，幾乎所有樣本中都存在癌細(xì)胞、ecm-myCAF、中間成纖維細(xì)胞、detox-iCAFs、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞類型。

Fig 1. OSCC患者樣本的ST分析和細(xì)胞反褶積實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述

2. 無監(jiān)督聚類結(jié)果顯示，TC和LE是腫瘤微環(huán)境的功能異質(zhì)性成分
在識別和注釋了主要由癌細(xì)胞組成的惡性腫瘤spot后，進(jìn)行了無監(jiān)督的louvain聚類，以揭示癌細(xì)胞表達(dá)譜的空間異質(zhì)性。生成了14個(gè)louvain簇，這些簇可被劃分為3個(gè)主要cluster。通過差異基因表達(dá)分析對主要的聚類進(jìn)行了表征。將cluster1標(biāo)注為“腫瘤核心”（TC），將cluster3標(biāo)注為“前沿”（LE）。cluster2由于其TC和LE DEG程序的組成而被注釋為“短暫性”。

從兩個(gè)空間區(qū)域內(nèi)的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)譜中生成了一個(gè)相關(guān)矩陣。在不同患者的TC內(nèi)和LE內(nèi)，通常觀察到高度的相關(guān)性。LE點(diǎn)顯示出與細(xì)胞周期、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和血管生成相關(guān)的基因的高表達(dá)。LE中的EMT評分也在很大的范圍內(nèi)表達(dá)，與EMT連續(xù)體模型一致。IPA預(yù)測了GP6、EIF2和HOTAIR調(diào)控典型信號通路在患者LE中的激活。這些特征可能反映了OSCC LE在控制侵襲性和轉(zhuǎn)移性行為中的作用。這些發(fā)現(xiàn)提示OSCC可能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)，并具有促進(jìn)或抑制腫瘤進(jìn)展的作用。
 

Fig 2. TC和LE是OSCC微環(huán)境中空間獨(dú)特的區(qū)域

3.TC和LE中的不同的癌細(xì)胞狀態(tài)
在幾個(gè)患者的同一腫瘤微環(huán)境中可能存在多個(gè)分子亞型，但亞型組成的模式并不一致。總體來說，基礎(chǔ)亞型的TC狀態(tài)最豐富，而非典型亞型的TC狀態(tài)最豐富。典型的OSCC標(biāo)記物在LE和TC之間的表達(dá)沒有顯著差異。此外，在整個(gè)UMAP投影中，CSC標(biāo)記物的表達(dá)均勻，表明CSC群體在整個(gè)OSCC腫瘤中均可見。TC和LE的獨(dú)特生物學(xué)譜可以通過獨(dú)特的癌細(xì)胞狀態(tài)的存在來解釋——保守的基因表達(dá)程序從特定的腫瘤微環(huán)境相互作用中動(dòng)態(tài)表現(xiàn)出來——包括CSC和非干細(xì)胞樣惡性細(xì)胞。先前探索動(dòng)態(tài)CSC狀態(tài)的文獻(xiàn)提出，LE中存在間充質(zhì)樣CSCs，TC中存在上皮樣CSCs。當(dāng)將與這些不同的CSC狀態(tài)相關(guān)的基因集評分到ST數(shù)據(jù)集時(shí)，結(jié)果證實(shí)了LE中間充質(zhì)樣CSC狀態(tài)存在高充質(zhì)樣CSC表達(dá)，TC中存在上皮樣CSC狀態(tài)。通過對連續(xù)組織切片的免疫熒光染色，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些CSC狀態(tài)的定位，發(fā)現(xiàn)CD24標(biāo)記在TC，CD44標(biāo)記在LE。這些發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)了TC和LE生態(tài)位內(nèi)的可塑性，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄獨(dú)特的癌細(xì)胞狀態(tài)的繁殖。

4. TC和LE結(jié)構(gòu)顯示出不同的配體-受體相互作用
使用CellChat軟件包進(jìn)行了細(xì)胞間的通信分析。ANGPTL、GRN、NECTIN和EPHB信號通路只存在于TC中，CSPG4只存在于LE中。一些ECM重構(gòu)途徑，包括膠原蛋白、肌腱蛋白和層粘連蛋白，在TC和LE中也有表達(dá)。相對于TC-TC信號通路，LE-LE信號通路中上調(diào)的輸出信號模式加強(qiáng)了這些通路在促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。

TC-TC癌細(xì)胞信號通路可以通過粘附配體-受體對DSC2-DSG1和ANGPTL4- SDC1等方式發(fā)生。LE-LE癌細(xì)胞可以通過粘附配體-受體對LAMB3- ITGA6_ITGB4和LAMB3-ITGA6_ITGB1，以及炎癥配體受體對MIF-CD74_CD44發(fā)出信號。MIF-CD74配體-受體對先前已經(jīng)被確定可以啟動(dòng)致癌信號通路。

相對于TC點(diǎn)，富集細(xì)胞毒性CD8（+）T細(xì)胞、ecm-myCAF、中間成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)的鄰近點(diǎn)數(shù)量顯著增加。TC和LE中的惡性細(xì)胞參與了不同的細(xì)胞-細(xì)胞通信模式，進(jìn)一步塑造了它們獨(dú)特的生物學(xué)特性。
 

Fig 3. TC和LE癌細(xì)胞狀態(tài)具有不同的實(shí)體，具有獨(dú)特的配體和受體相互作用

5. TC和LE基因特征在癌癥中是保守的，它們對預(yù)后的影響是不同的
在TC點(diǎn)、LE點(diǎn)和所有其他剩余的點(diǎn)上訓(xùn)練了三個(gè)基于機(jī)器學(xué)習(xí)（ML）概率的預(yù)測模型，以生成一個(gè)空間-區(qū)域預(yù)測模型。將預(yù)測ML模型應(yīng)用于橫跨17種不同癌癥類型的30個(gè)公開可用的ST樣本，以描述每個(gè)樣本中的每個(gè)點(diǎn)為“TC”、“LE”、“短暫性”或“其他剩余點(diǎn)”。模型10倍交叉驗(yàn)證顯示，在所有模型中LE區(qū)域的ROC最低，因?yàn)槠潇`敏度相對較低，為0.694。在黑色素瘤（SKCM）、結(jié)直腸腺癌（COAD）、皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cSCC）和宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CESC）樣本的空間分離癌細(xì)胞狀態(tài)中表現(xiàn)良好。在所有30個(gè)樣本中都發(fā)現(xiàn)了高度空間分離的LE點(diǎn)。模型在識別cSCC、黑色素瘤、CESC和COAD組織切片中的TC斑點(diǎn)方面表現(xiàn)特別好，這可能歸因于這些癌癥中存在角化程序。這些開創(chuàng)性的結(jié)果表明，LE相關(guān)的表達(dá)狀態(tài)在多種癌癥環(huán)境中是保守的，而與TC相關(guān)的表達(dá)譜更具有組織特異性。

為了檢驗(yàn)LE和TC的預(yù)后意義，納入了來自包含匹配生存數(shù)據(jù)的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集（TCGA）的樣本。共選擇275例hpv陰性O(shè)SCC患者進(jìn)行生存分析，根據(jù)TC和LE中差異表達(dá)基因的表達(dá)對每個(gè)樣本進(jìn)行富集評分。生成Kaplan-Meier曲線，以可視化總生存（OS）、疾病特異性生存（DSS）和無進(jìn)展間期（PFI）與TC和LE信號高或低表達(dá)之間的差異。

由于LE狀態(tài)似乎適用于不同的癌癥類型，進(jìn)一步確定了LE特征對預(yù)后的影響，并將分析擴(kuò)展到TCGA中的20種常見實(shí)體腫瘤。在多種癌癥中，除了OS和肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）外，高LE評分與較差的OS和DSS始終相關(guān)。除了黑色素瘤（SKCM）和LUSC外，LE和PFI之間也存在類似的關(guān)聯(lián)模式。較低的TC特征評分與較高的淋巴結(jié)分期、淋巴血管侵犯、較高的腫瘤分級、陽性邊緣和囊外擴(kuò)散；而較高的LE特征評分與任何臨床特征無關(guān)。
 

Fig 4. 機(jī)器學(xué)習(xí)模型識別了多種癌癥類型的保守TC和LE特征

6. 通過分析TC和LE之間的RNA剪接動(dòng)力學(xué)，揭示了分化軌跡
利用scVelo，它通過解釋基因特異性轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)，建立在RNA速度的基礎(chǔ)上，來表征TC和LE中存在的癌細(xì)胞的發(fā)育軌跡。在空間去卷積的癌細(xì)胞中免疫球蛋白（Ig）基因已在幾種上皮性癌癥中檢測到。雖然確切的機(jī)制尚不清楚，但腫瘤來源的Igs與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、免疫逃逸和EMT樣表型的介導(dǎo)有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)預(yù)測，TC經(jīng)歷了分化增加，保留了上皮樣表型，而LE變得越來越間充質(zhì)。TC和LE中其他差異剪接的驅(qū)動(dòng)基因包括原癌基因和腫瘤抑制基因。

7. 獲得OSCC的治療靶點(diǎn)
應(yīng)用了一種計(jì)算機(jī)微擾方法來識別可能預(yù)測OSCC治療成功的RNA速度的保守模式。分析了至少25個(gè)HPV陰性HNSCC細(xì)胞系中417種藥物的PharmacoDB藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)140種藥物-基因相互作用被確定為從DGIdb70上調(diào)或下調(diào)。在高AAC藥物相對于低AAC藥物的凈流出LE轉(zhuǎn)移概率的定量測量顯著增加。在幾種無效藥物(低AAC)中發(fā)現(xiàn)了相反的表型，顯示出與基線狀態(tài)相似的過渡層次。
 

Fig 6. RNA剪接動(dòng)力學(xué)分析揭示了TC和LE的不同發(fā)育軌跡和治療脆弱性

參考文獻(xiàn)：
Arora R, Cao C, Kumar M, Sinha S, Chanda A, McNeil R, Samuel D, Arora RK, Matthews TW, Chandarana S, Hart R, Dort JC, Biernaskie J, Neri P, Hyrcza MD, Bose P. Spatial transcriptomics reveals distinct and conserved tumor core and edge architectures that predict survival and targeted therapy response. Nat Commun. 2023 Aug 18;14(1):5029. doi: 10.1038/s41467-023-40271-4IF: 16.6 Q1 . PMID: 37596273; PMCID: PMC10439131.