摘要
減少固相多肽合成（SPPS）過(guò)程產(chǎn)生的雜質(zhì)，對(duì)于可靠的結(jié)果分析來(lái)說(shuō)非常重要。然而，因?yàn)樯�譜純化的方式無(wú)法進(jìn)行多肽平行純化，所以在進(jìn)行多肽藥物篩查（N＞24）的過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)使用一些低純度的粗肽，這對(duì)最終的結(jié)果分析非常不友好。但是，目前我們使用PurePep EasyClean(PEC)技術(shù)在96孔板里進(jìn)行多肽的平行純化，成功突破了這一瓶頸。

引言
在多肽藥物篩查過(guò)程中，需要測(cè)試數(shù)百種不同的多肽，這對(duì)多肽藥物的驗(yàn)證或進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系的研究至關(guān)重要。目前利用基于Fmoc策略的固相多肽合成（SPPS）方法可以快速合成大量多肽樣品。但是在合成過(guò)程中，由于多肽鏈的截?cái)嗷虬被�酸的缺失等原因，氨基酸的偶�?lián)效率無(wú)法達(dá)到100%，因此不可避免的會(huì)產(chǎn)生一些雜質(zhì)，通常這些雜質(zhì)我們會(huì)通過(guò)反向高效液相色譜（RP-HPLC）的方法去除。然而，反向高效液相色譜（RP-HPLC）受到通量的限制，即每個(gè)純化柱一次只能純化一個(gè)多肽。因此多肽藥物篩選主要是基于粗肽來(lái)進(jìn)行，會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果假陽(yáng)性或假陰性的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，極大阻礙了多肽藥物開(kāi)發(fā)的進(jìn)展。在此項(xiàng)案例研究中，我們介紹一種可以高效平行純化多肽的方法，利用Purepep EasyClean(PEC)技術(shù)，使用多孔板和真空歧管，實(shí)現(xiàn)一次快速平行純化96個(gè)多肽（每個(gè)多肽最大10μmol），以此來(lái)推動(dòng)高效可靠的多肽藥物開(kāi)發(fā)工作。

方法
合成
在Ramage-Amide-DP-樹(shù)脂上以10μmol規(guī)模在96孔板中（1×45分鐘，5倍過(guò)量氨基酸）平行合成2×96個(gè)肽，然后進(jìn)行常規(guī)封端反應(yīng)（2M Ac2O，2M pyridine，1×5分鐘）。封端步驟可以確保PEC Linker連接子RC+（4倍當(dāng)量）選擇性偶聯(lián)到目標(biāo)肽上，偶聯(lián)時(shí)間2個(gè)小時(shí)（6倍當(dāng)量DIPEA，6倍當(dāng)量Oxyma），序列由英國(guó)Durham大學(xué)化學(xué)系Steven Cobb提供。使用TFA/H2O/EDT/PhSMe/TIS（83:5:5:5:2，每10 μmol肽0.5 mL裂解液）進(jìn)行TFA裂解2h。收集粗肽，沉淀，離心并在96孔板中干燥。圖1顯示了96個(gè)序列中氨基酸的加權(quán)分布。
 

圖 1 肽庫(kù)序列示意圖

PEC純化
為了進(jìn)行肽庫(kù)序列的高通量平行純化，PEC純化的操作程序適應(yīng)了96孔板的使用設(shè)計(jì)。因此，在連接有Linker連接子的修飾肽溶解后，所有后續(xù)的步驟借助真空歧管在96孔板上進(jìn)行，可實(shí)現(xiàn)連接子從開(kāi)始偶聯(lián)到最終無(wú)痕釋放的全過(guò)程。第一個(gè)96孔板上合成的粗肽利用PEC純化技術(shù)純化，最終收集在深孔板上并直接凍干；第二個(gè)96孔板的合成的粗肽不進(jìn)行PEC純化，而是裂解、沉淀、溶解在 H₂O/MeCN (7:3) + 0.1% TFA 溶液中進(jìn)行分析并凍干，以確定粗純度和產(chǎn)量。

分析
在 Waters 的 Acquity H-Class UPLC-ESI-MS 系統(tǒng)上，利用C-18 柱（1.7 μm，2.1 x 500 mm）進(jìn)行純度分析和質(zhì)譜鑒定；流動(dòng)相為含有 0.1% TFA 的H₂O（A）和 MeCN（B）混合液；使用已知 210 nm 處消光系數(shù)的試劑（0.1 mg/mL Fmoc-L Glutamic acid (OtBu) monohydrate solution）作為內(nèi)標(biāo)計(jì)算回收率。²
 

圖 2 粗品和 PEC 級(jí) SCP12 和 SCP31 在 210 nm 處的 UPLC-UV/VIS 色譜圖

結(jié)果和討論
使用 PEC 技術(shù)可使 96 種肽的平均純度提高 19%（表 1）。

表 1 粗肽和 PEC 級(jí)肽的平均結(jié)果

利用PEC技術(shù)純化后的肽庫(kù)沒(méi)有檢測(cè)到截短序列，并且只有一種肽的純度低于 70%（圖 3）。與未純化的粗肽相比，這是一個(gè)明顯的改進(jìn)，在未純化的粗肽肽庫(kù)中，只有18種肽的純度高于80%（圖3）。PEC級(jí)肽的總體回收率為48%。
 

圖 3  96種肽的粗品純度和 PEC 級(jí)純度分析

圖2顯示了兩種代表性肽的粗肽和PEC級(jí)純化肽的比較色譜圖。例如SCP31肽（圖2，左）體現(xiàn)了PEC純化技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：可以有效去除截短序列。這個(gè)特點(diǎn)在未優(yōu)化的合成過(guò)程中至關(guān)重要。在肽庫(kù)的制備中，由于96條肽中有76條在其序列中具有一個(gè) Asp-Gly 片段，雜質(zhì)大部分是由天冬酰亞胺的形成而產(chǎn)生的，如圖 2（右）所示。平均而言，由天冬酰亞胺的形成引起的雜質(zhì)占總雜質(zhì)的7%。

盡管 PEC 無(wú)法完全去除這些雜質(zhì)，但PEC技術(shù)純化的結(jié)果也已經(jīng)表現(xiàn)了相當(dāng)?shù)臐摿Γ豪�如使�?Asp(Dmb/Hmb)Gly 構(gòu)建塊，將使96條肽的平行純化平均純度達(dá)到87%。

結(jié)果一覽
1. 使用 96 孔板形式的PEC純化可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行多肽純化
2. 一種方法適用于所有的程序，PEC級(jí)的肽平均純度為87%
3. 通過(guò)消除多肽相關(guān)雜質(zhì)來(lái)提高檢測(cè)可信度

高通量多肽純化試劑盒
PTI（Protein Technologies, Inc.）公司的高通量多肽純化試劑盒采用獨(dú)特的PEC純化技術(shù)，進(jìn)行大規(guī)模多肽快速平行純化以保證高度可靠的分析結(jié)果。一種純化方法適用于所有種類(lèi)多肽純化，并且一次可平行純化48或96個(gè)多肽，平均純度高達(dá)85%以上；還可降低95%的溶劑消耗量和有機(jī)廢液的產(chǎn)生，極大降低純化成本，非常適合PEC級(jí)肽庫(kù)的構(gòu)建，大大提高篩選和分析結(jié)果的可靠性。
 

多肽合成、切割、純化——三位一體多肽合成儀

PurePep®Chorus多肽合成儀結(jié)合了穩(wěn)定自動(dòng)化的多肽合成、多肽切割及多肽純化；可先平行合成6條不同肽序，并原位切肽，然后在同一臺(tái)儀器上，平行純化6條多肽；使用感應(yīng)加熱能快速合成多肽，同時(shí)正交捕獲-釋放PurePep EasyClean (PEC)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)高效多肽純化；可有效應(yīng)用于疏水肽(hydrophobic peptides)及聚集肽(aggregating peptides)的合成與純化。

參考文獻(xiàn)
[1] J. R. Currier et al. Clin Vaccine Immunol 2008,15, 267-276
[2] B. J. H. Kuipers; H. J. Gruppen Agr. Food Chem. 2007, 55, 5445-5451