• 將自動流式細(xì)胞儀與圖像處理的細(xì)胞圖像流相結(jié)合，可以估算藻細(xì)胞生長率; 
• 凱倫藻（Karenia selliformis）在赤潮期間表現(xiàn)出低生長率; 
• 在藻華期間，Karenia selliformis可能存在磷限制; 
• 潮汐動態(tài)在Karenia selliformis生物量積累中起著關(guān)鍵作用。

摘要
2019年秋季，在加貝斯灣（地中海）發(fā)生了一次凱輪藻（Karenia selliformis）赤潮事件，利用配備流動成像模塊的自動流式細(xì)胞儀（Cytosense, Cytobuoy b.v.）進(jìn)行了為期9天的高頻監(jiān)測。該儀器記錄了光學(xué)信號的形狀，從而分辨了有害藻類大量繁殖期間的六個細(xì)胞群，包括微微型浮游植物 (picophytoplankton)，微型浮游植物 (nanophytoplankton)和小型植物型浮游植物 (microphytoplankton)。通過分析每小時(shí)記錄得到的凱輪藻細(xì)胞尺寸，估算了赤潮期間的日分裂率。結(jié)果顯示，凱倫藻是唯一形成赤潮的物種，并在調(diào)查的第四天達(dá)到了最高的平均豐度。營養(yǎng)鹽組成發(fā)生了變化，赤潮爆發(fā)期可能存在磷（P）限制，而大赤潮衰退期可能存在氮（N）限制。協(xié)慣量分析顯示，凱倫藻和異養(yǎng)原核生物呈相反的模式，表明了它們之間的營養(yǎng)相互作用以及赤潮結(jié)束時(shí)凱倫藻可能出現(xiàn)混合營養(yǎng)行為。凱倫藻的生長率普遍較低，通常日分裂率<1/d，此數(shù)值無法解釋觀察到的高豐度。潮汐在半日和春潮-露潮尺度上對凱倫藻動態(tài)起著至關(guān)重要的作用，并可能增強(qiáng)了凱倫藻的積累。

在這項(xiàng)研究中，報(bào)告了對加貝斯灣中凱倫藻進(jìn)行高頻率原位監(jiān)測的結(jié)果。以小時(shí)為單位時(shí)間尺度對赤潮動態(tài)進(jìn)行了調(diào)查，以解決以下問題：（1）觀察到的赤潮是否為單一種類，并且是否與其他浮游植物群體，尤其是超微型浮游植物（<10 µm），存在相互作用？（2）凱倫藻在赤潮期間的養(yǎng)分需求是什么，赤潮期間養(yǎng)分組成是否發(fā)生了變化？（3）在赤潮期間，高生物量是否由純物理過程維持，還是由于種群的內(nèi)在固有特征（即，高生長率）？

材料與方法

采樣區(qū)域
取樣是在2019年秋季（從9月27日至10月5日）在突尼斯斯法克斯（Sfax）的商業(yè)港口進(jìn)行的，此前當(dāng)?shù)卣�府�?bào)告了水體變色情況。斯法克斯港口位于加貝斯灣北岸的工業(yè)區(qū)域內(nèi)，該地區(qū)是突尼斯海岸沿線赤潮事件的主要熱點(diǎn)區(qū)域（見圖1）。大多數(shù)事件發(fā)生在秋季和春季，而主要的有害赤潮物種是凱倫藻屬（Karenia selliformis）（Feki等人，2017年）。盡管屬于東地中海盆地寡營養(yǎng)區(qū)，但加貝斯灣非常富有生產(chǎn)力，占突尼斯?jié)O業(yè)生產(chǎn)的65％（DGPA，2005–2009）。它是海龜?shù)闹�名棲息地（Jribi等人，2008年；Lotze和Worm，2009年；Maffucci等人，2006年）。盡管加貝斯灣對當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)和野生動物保護(hù)具有特殊重要性，但仍然受到城市化、工業(yè)、漁業(yè)、旅游和人為排放的強(qiáng)大壓力（B´ejaoui等人，2004年；Ben Brahim等人，2010年；Rekik等人，2012年）。
 

水文要素
采樣使用手持式多參數(shù)儀器（WTW Multi 340i/SET）對溫度、鹽度和pH進(jìn)行了每小時(shí)的測量。潮汐振幅，即高潮和落潮之間的差異，被視為表示潮汐影響的變量，從位于斯法克斯港口的潮汐測站獲取，由突尼斯海洋水文和海洋服務(wù)部門運(yùn)營。從3米深處使用一臺5馬力的潛水電泵連續(xù)將港口的亞表層海水泵入。每3小時(shí)收集一次營養(yǎng)分析樣品，裝入清潔的50 cm³聚碳酸酯瓶中，并立即存放在-80°C。

浮游植物采樣策略
1. 采用高頻率采樣（1小時(shí)間隔）模式來監(jiān)測浮游植物動態(tài)。使用了Cytosense自動流式細(xì)胞儀（Cytobuoy b.v. (NL)），該設(shè)備設(shè)計(jì)用于研究0.8-800 µm之間的單個或群體浮游植物細(xì)胞。Cytosens分析了來自連續(xù)流通系統(tǒng)的海水，該系統(tǒng)以3米深處抽取，流速為1dm3/min，將樣品導(dǎo)入中間的300cm3容器進(jìn)行隔離并盡量減少分析涵蓋的體積。使用重量校準(zhǔn)的蠕動泵將樣品流速設(shè)置為5 mm3/s，導(dǎo)入鞘液循環(huán)（經(jīng)過0.2 µm過濾的NaCl溶液（35‰）），細(xì)胞在流動軸方向被分離和排列，然后被激光束（OBIS Coherent，488 nm，120 mW）檢測。使用兩個0.1 µm過濾器的組合不斷回收鞘液。前向光散射（FWS）被收集到兩個左右光電二極管上，并用于激光對準(zhǔn)控制。側(cè)向光散射（SWS）和熒光發(fā)射通過一組光學(xué)濾波器（SWS（488 nm），黃色熒光（FLY，506–601 nm），橙色熒光（FLO，601–650 nm）和紅色熒光（FLR，> 650 nm））分離并收集到光電倍增管上。每24-72小時(shí)使用直徑為3µm（Cyto-Cal™）和10µm（Polybead®）的熒光珠進(jìn)行熒光和大小的校準(zhǔn)。硅膠珠（Bangs lab®，二氧化硅微球），直徑為1.0、2.02和3.13µm，用于估算浮游植物細(xì)胞的大小。

2. 根據(jù)其光散射和熒光特性對浮游植物群進(jìn)行了光學(xué)分辨。對于每個樣品，記錄了兩次連續(xù)的分析，分別設(shè)置兩個不同的FLR信號（10和20 mV）觸發(fā)，以優(yōu)化低葉綠素含量和高葉綠素含量細(xì)胞的分析。浮游植物群落使用Cytoclus©軟件進(jìn)行分類。因此，每個細(xì)胞都通過一組光學(xué)脈沖形狀進(jìn)行表征，這構(gòu)成了細(xì)胞學(xué)特征。使用不同尺寸的微球珠區(qū)分了藍(lán)藻（光合原核生物）、微微型真核藻（picoeukaryotes）、微型浮游植物和小型浮游植物。

3. 異養(yǎng)原核生物的豐度分析：每隔3小時(shí)，將1.8 cm³海水亞樣品立即用0.2 cm³ 20％的多聚甲醛（PFA）溶液固定，使用死亡移液管（Vives-Rego等人，2000年），并放置在4°C的黑暗中15分鐘，然后在液氮-80°C存儲在，直到使用CyFlow space Partec流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，方法見Khammeri等人（2020年）。

4. 對于picoeukaryotes和 nanoeukaryotes，根據(jù)不同尺寸的的微球進(jìn)行預(yù)測量，與其等效的細(xì)胞學(xué)前向散射特征（FWS）之間的校準(zhǔn)關(guān)系，估算細(xì)胞生物體積。對于凱倫藻等細(xì)胞，細(xì)胞大小是通過儀器中的流動成像模塊生成的圖像確定的。使用Cytoclus 4軟件進(jìn)行細(xì)胞大小測量。使用此方法處理了超過200個圖像。然后建立了細(xì)胞生物體積與前向散射特征（FWS）之間的關(guān)系。對每個群體分配一個系數(shù)，將生物體積轉(zhuǎn)換為碳生物量。例如凱倫藻（Lessard，1991年）和藍(lán)細(xì)菌Synechococcus（Mackey等人，2002年）的系數(shù)分別為0.14 pg C/µm和200 fg C/cell。Picoeukaryotes 和 nanoeukaryotes碳生物量使用Verity等人（1992年）的方程計(jì)算：

Q_{c, cal} = aV^0.866

Q_{c, cal}：估算的每個細(xì)胞的平均碳生物量(fg C/cell)，V：生物體積 (µm³)，“a”值不同物種不同,分別為: Synechococcus=0.39, picoeukaryotes=0.32,  nanoeukaryotes=0.27, cryptophytes=0.25。

最小和最大平均細(xì)胞生物體積之間的比率已用于估計(jì)每日生長速率 (Binder等人，1996; Vaulot和Marie，1999)。這種方法假設(shè)，對于給定的群落，生長和分裂階段是同步的：

μ_ratio = Log(V_max / V_min)

其中μ_ratio是每日生長率（d^-1），V_max和V_min分別是最大和最小的平均細(xì)胞生物體積（µm³/cell）。

表觀碳生物量的增加，定義為凈初級生產(chǎn)力（NPP），單位為mgC m³ d^-1，使用碳轉(zhuǎn)換因子Q_{c, cal}與N（豐度）和指數(shù)生長率的數(shù)量積進(jìn)行計(jì)算。

NPP=Q_{c, cal}×[e^μ_ratio-1]×N

結(jié)果討論

1. 營養(yǎng)鹽
在取樣期間，溫度在27-30°C之間波動，最高值出現(xiàn)在赤潮期的前五天，赤潮結(jié)束時(shí)下降了1.5°C（圖2A）。平均鹽度相對穩(wěn)定，在39左右，但偶爾出現(xiàn)低于38.5的數(shù)值（圖2B）。pH值從赤潮開始的7.85變化到結(jié)束時(shí)的8.52（圖2C）。
赤潮期間，氮主要以銨的形式存在，其濃度在0.25-18.91 µM的范圍內(nèi)變化（圖2D）。硝酸鹽和亞硝酸鹽的平均濃度在約2.17 μM左右波動。它們在第三和第四天顯示出超過4 µM，并在第六天達(dá)到了最大值9.5 µM。磷在赤潮初期（從第1天到第3天）相對較低，然后逐漸增加，在赤潮結(jié)束時(shí)顯示出最高值（4 µM）。N：P比值通常在赤潮開始階段（從第1天到第5天）高于16，顯示出潛在的磷限制，而在赤潮結(jié)束時(shí)（從第6天到第10天）低于16，表明可能存在氮限制（圖4）。硅酸鹽平均波動在4 µM左右，在赤潮期間相對穩(wěn)定，除了第4天記錄的單個高值（19 µM）。

2. 浮游植物和異養(yǎng)原核生物群落組成
根據(jù)材料和方法部分描述的細(xì)胞光學(xué)特性，通過流式細(xì)胞儀解析了六個浮游植物功能群（圖3）。在FLR vs. FLY和FLY vs. FWS圖上，區(qū)分了三個富含藻紅蛋白的聚類，通過其高FLY（藻紅蛋白）進(jìn)行區(qū)分。識別為Synechococcus的聚類6細(xì)胞，計(jì)算的大小估計(jì)為1.77 ± 0.05 µm。聚類3和聚類4的細(xì)胞的計(jì)算大小分別為3.32 ± 0.74和14.25 ± 2.09 μm，并分別識別為類隱藻和隱藻。

Picoeukaryotes和 nanoeukaryotes細(xì)胞具有較高的FLR和低的FLY，計(jì)算的大小分別估計(jì)為2.11 ± 0.04和3.71 ± 0.22 μm。聚類1的細(xì)胞表現(xiàn)出最高的FLR，相對較低的FLY，計(jì)算的大小估計(jì)為31.2 ± 1.65 μm。對于聚類1收集的細(xì)胞圖片，首次將其識別為Karenia selliformis（圖3C）。通過16S rDNA V4序列的代謝條形碼和系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。在赤潮期間收集的5個樣品中，真核生物群落的多樣性分析顯示出存在14個作為Karenia屬的ASV（補(bǔ)充表1）。Karenia selliformis_ASV1是在監(jiān)測期間檢測到的最豐富的真核生物ASV，其相對豐度在赤潮期開始（第2天）和結(jié)束（第8天）之間變化，分別為45.20％至17.53％。其他Karenia ASVs的表示非常少，最大相對豐度<2％。屬于八個Kareniaceae物種的18S rDNA V4區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3D）顯示，主導(dǎo)的K. selliformis_ASV1序列與K. selliformis CAW79（100％一致）聚類，從而確認(rèn)了赤潮物種的識別為K. selliformis。
在監(jiān)測期間，Karenia selliformis的貢獻(xiàn)在聚類1中的減少也通過相機(jī)輸出圖像觀察到（檢查了200多塊板），顯示該物種在赤潮的前六天中占據(jù)了超過90％的微生物，而在赤潮結(jié)束時(shí)約為20％，并出現(xiàn)了其他微型浮游物種，如斜紋硅藻Pleurosigma sp.和一些纖毛蟲。K. selliformis的豐度在監(jiān)測期間波動在103至27 × 103 cell/cm³之間（圖4）。在第一個監(jiān)測日（2019年9月27日），Karenia selliformis的濃度在103至9 × 103個cell/cm³之間變化，這對應(yīng)于赤潮的良好生長階段（圖4）。最高濃度記錄在第5個監(jiān)測日（2019年10月1日），這對應(yīng)于春潮期。在此日期之后，濃度急劇下降，最終在監(jiān)測結(jié)束時(shí)達(dá)到約（103cell/cm³），對應(yīng)于退潮期，此時(shí)潮汐振幅變化小于1米。濃度的晝夜變化顯示，在高潮時(shí)記錄到最大值，而在低潮時(shí)記錄到最小值，證明了潮汐對赤潮的控制（圖4）。

Synechococcus和微型真核生物是最多的超微浮游植物群（見圖5），平均濃度約為104和2 × 103cell/cm³。它們在第一個監(jiān)測日展示了最高的濃度。Synechococcus的濃度在赤潮結(jié)束時(shí)急劇下降至< 102cell/cm³。類隱藻的濃度約為102cell/cm³，在赤潮結(jié)束時(shí)保持了穩(wěn)定的濃度，而更大的隱藻在赤潮結(jié)束時(shí)減少。異養(yǎng)原核生物的濃度平均波動在2 × 106cell/cm³左右，并沒有特定的變化趨勢。Karenia selliformis聚類在系統(tǒng)中占據(jù)了超過90%的碳生物量（見圖6），在第6天后，對碳生物量的貢獻(xiàn)減少到不到80%，而納米真核生物和隱藻的貢獻(xiàn)增加了（見圖6）。

3. Karenia selliformis的生長率和凈初級生產(chǎn)力
Karenia selliformis細(xì)胞平均大小的晝夜變化顯示出相當(dāng)同步的分布，這意味著細(xì)胞的生長和分裂在時(shí)間上是分開的。大小變化呈現(xiàn)出明顯的晝夜變化模式（見圖7），與文獻(xiàn)描述相符（Weiler和Chisholm，1976）。細(xì)胞生長始于黎明（大約上午5點(diǎn)），記錄到的最小細(xì)胞大小約為28 µm，而細(xì)胞分裂主要發(fā)生在夜間（大約晚上7點(diǎn)），最大細(xì)胞大小約為33 µm。尺寸譜的分析（見圖7）顯示，群落在赤潮爆發(fā)期的指數(shù)階段顯示出同步分布，而在赤潮結(jié)束時(shí)非同步分布，可能是由于群落的多種構(gòu)成導(dǎo)致較大尺寸物種的出現(xiàn)（見圖8B）。

計(jì)算的生長速率在赤潮期的前幾天顯示出一般上升的趨勢（見圖8C），在第6天達(dá)到最大值，為0.76/d，相當(dāng)于每天超過1次分裂。在赤潮衰減期間，生長速率約為0.6/d。凈初級生產(chǎn)力（NPP）在赤潮增長階段顯示出下降趨勢，第6天達(dá)到約14 mg C/m³/day的最大值，然后在赤潮結(jié)束時(shí)迅速下降至小于0.5 mg C/m³/day（第9天）。

結(jié)論

1. 建立長期監(jiān)測將對赤潮爆發(fā)、生長和崩潰的條件提供非常有用的信息。如果監(jiān)測站點(diǎn)是復(fù)發(fā)性HAB的熱點(diǎn)地區(qū)，例如被認(rèn)為加貝斯灣赤潮熱點(diǎn)的半封閉的Boughrara瀉湖（Feki-Sahnoun等，2017年；Feki-Sahnoun等，2020年），那么建立高頻率監(jiān)測可能會更加有效。
2. 在大尺度（每周取樣）上調(diào)查的赤潮與環(huán)境變量（溫度和鹽度）之間的關(guān)系可能更多地表現(xiàn)為相關(guān)性而不是因果關(guān)系，而在更短時(shí)間尺度（1小時(shí)）上進(jìn)行高分辨率觀察可能更能凸顯環(huán)境變量和Karenia selliformis赤潮之間的因果關(guān)系。

3. 在物種組成方面，Karenia selliformis的暴發(fā)在生長期和穩(wěn)定期的最初幾天幾乎是單一物種，但在暴發(fā)衰退期間則趨于多樣化。自動圖像分類機(jī)制在提供微型浮游植物組成中各物種相對貢獻(xiàn)的準(zhǔn)確估計(jì)方面會更加有用（Campbell等人，2010）。Feki-Sahnoun等人（2020）使用樸素貝葉斯分類器模型框架分析了Karenia selliformis暴發(fā)期間和之后的物種組成，得出了不同的結(jié)論，顯示Karenia selliformis在暴發(fā)期間與一些裸藻和甲藻相關(guān)。這種差異可能源于所涉及調(diào)查的時(shí)間尺度不同。在每周監(jiān)測中被認(rèn)為是暴發(fā)的現(xiàn)象在高頻率調(diào)查中可能對應(yīng)于暴發(fā)結(jié)束，因此可能反映出類似的多種物種組成，而暴發(fā)在其開始時(shí)是單一物種的。

4. Karenia selliformis的生長速率和產(chǎn)量對生物量積累的影響。Karenia selliformis像大多數(shù)甲藻一樣，復(fù)制非常緩慢，每天的分裂少于1次（Brand等，2012）。在暴發(fā)期間測得的生長速率證實(shí)了這一說法，在暴發(fā)生長期和穩(wěn)定期內(nèi)，每天的分裂次數(shù)幾乎不到一次（<0.69 d⁻¹），第6天的分裂次數(shù)超過一次，暴發(fā)結(jié)束時(shí)接近每天一次分裂（圖8）。問題在于Karenia selliformis如何在相對較低的生長速率下實(shí)現(xiàn)這種生物量積累。有人可能會質(zhì)疑基于最大和最小平均生物體積比率的生長速率估計(jì)。這種簡單的方法假設(shè)細(xì)胞的生長和分裂是分時(shí)進(jìn)行的（同步群體），而實(shí)際上這些過程在群體中是同時(shí)發(fā)生的（Waterbury等，1986；Binder和Chisholm，1995；Jacquet等，2001）。使用Sosik等人（2003）描述的大小結(jié)構(gòu)化種群模型對整個整合期內(nèi)的細(xì)胞生長和分裂進(jìn)行建模，更能代表非同步群體（Dugenne等，2014；Marrec等，2018），并導(dǎo)致高于中位數(shù)尺寸比率的生長速率估計(jì)µratio = ln(vmax/vmin)（Marrec等，2018）。在最大生物量期內(nèi)，由于尺寸譜的分解（圖7），生長速率估計(jì)受這種限制的影響較小，顯示出在暴發(fā)高峰期的分布相當(dāng)緊湊，這主要受光/暗周期的控制（Ralston等，2007），而在暴發(fā)結(jié)束時(shí)尺寸分布更為分散（圖7）。

總結(jié)
基于流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合圖像處理的浮游植物細(xì)胞尺寸的晝夜變化代表了一種有趣的技術(shù)，用于在高頻調(diào)查期間計(jì)算自然浮游植物群體的生長速率。此外，利用這種技術(shù)監(jiān)測有害藻華非常有用，因?yàn)樗�可以識別赤潮物種及其在種群和內(nèi)在水平上的動態(tài)。
研究指出，Karenia selliformis的豐度與營養(yǎng)成分之間存在高度相關(guān)性，暴發(fā)生長期可能受到磷（P）的限制，暴發(fā)結(jié)束時(shí)則可能受到氮（N）的限制。由于生態(tài)系統(tǒng)中特別富含有機(jī)物質(zhì)和異養(yǎng)原核生物，Karenia selliformis的混合營養(yǎng)行為也不能被排除。
在監(jiān)測的最初幾天，Karenia selliformis幾乎表現(xiàn)為單一物種的暴發(fā)。計(jì)算的生長速率總體顯示較低值（<1次分裂/天），因此不足以解釋積累的生物量。潮汐動態(tài)似乎在爆發(fā)濃度中起到了主要作用。確定物理運(yùn)輸和凈生長對某一地區(qū)物種積累的貢獻(xiàn)是值得研究的。
  Boudriga I, Abdennadher M, Khammeri Y, et al. Karenia selliformis bloom dynamics and growth rate estimation in the Sfax harbour (Tunisia), by using automated flow cytometry equipped with image in flow, during autumn 2019[J]. Harmful Algae, 2023, 121: 102366.