近十年，腫瘤微環(huán)境作為腫瘤研究領(lǐng)域的分支之一，在很多方面取得了進展，其重要原因在于腫瘤樣本組織具有與生物復雜性相關(guān)的顯著空間異質(zhì)性。而腫瘤微環(huán)境研究可以揭示其中奧秘。

 

多重免疫熒光染色作為腫瘤微環(huán)境研究的重要手段之一，可以同時顯示多種生物標志物，實現(xiàn)識別細胞類型，以及研究信號通路和繪制腫瘤微環(huán)境中復雜的細胞互作圖譜。

 

盡管近年出現(xiàn)幾種新技術(shù)，但在生物標志物發(fā)現(xiàn)和診斷領(lǐng)域工作的研究人員和臨床醫(yī)生仍然面臨技術(shù)瓶頸：1）組織微陣列技術(shù)的使用受到腫瘤異質(zhì)性限制，2）新型多維度空間生物學技術(shù)成本高昂。

 

在此背景下，Innopsys 開發(fā)了 InnoQuant熒光全玻片掃描儀，其具有經(jīng)過優(yōu)化的獨特光學設計，可提供高質(zhì)量免疫熒光染色圖片，有助于高內(nèi)涵數(shù)據(jù)的生成和分析。

 

NSCLC多重組織成像的案例研究

 

研究非小細胞肺癌(NSCLC)中癌癥組織中的免疫浸潤

 

非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的85%。目前，使用靶向腫瘤特定分子特征的治療藥物已成為標準方案。因此，研究腫瘤組織樣本，以此來表征免疫細胞和免疫檢查點有助于個體化的靶向治療。

 

 

1)PD-L1是一種免疫檢查點標志物，在髓系細胞和腫瘤細胞中表達，并作為癌癥免疫治療的潛在靶點，本實驗中作為腫瘤細胞標志物。

2)顆粒酶B (Granzyme B，GrB)是一種絲氨酸蛋白酶顆粒酶，主要存在于自然殺傷細胞(NK細胞)和細胞毒性T細胞的顆粒中，本實驗中作為NK細胞標志物。

3)CD8存在于T細胞中，本實驗中作為細胞毒性T細胞標志物。

4)使用Cell Signaling 公司mIHC熒光抗體進行非小細胞肺癌樣本染色，具體如下: FITC標記PD-L1，AF594標記CD8，Cy5標記GrB。

 

 

1)利用GrB標記物鑒定NK細胞：采用640 nm激發(fā)波長產(chǎn)生Cy5信號，通過680/42 BP濾波器采集其發(fā)射信號。

2)利用CD8標記物鑒定T細胞：采用561nm激發(fā)波長產(chǎn)生AF594信號，通過593/40 BP濾波器采集其發(fā)射信號。

 

 

利用QuPath的深度學習功能，分別識別NK細胞和CD8+ T細胞。采用Delauney聚類特征2D法鑒定NK細胞簇和CD8+ T細胞簇。分析3個相鄰NK或CD8+ T細胞所包圍的三角形面積與 腫瘤區(qū)域邊界到NK或CD8+ T細胞中心距離之間的關(guān)系。

 

 

冷凍切片厚度:5μm。冷凍切片總面積:97 mm²。4個熒光通道掃描時間:10分鐘。ROI面積:2 mm²（圖1）。

圖1:NSCLC組織切片全圖，mIHC染色，InnoQuant掃描，后續(xù)分析ROI用黃色圈出

 

 

圖2中黃色標記區(qū)域為腫瘤細胞區(qū)域，藍色標記NK細胞分布在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)部和外部。圖中大部分NK細胞集中在腫瘤細胞區(qū)域周圍，部分NK細胞在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)。

 

圖2:腫瘤細胞區(qū)域微環(huán)境中NK細胞簇的ROI和細節(jié)（腫瘤細胞區(qū)域用黃色標出，NK細胞呈藍色；圖片由InnoQuant獲取，QuPath分析）

 

三個NK細胞間面積（μm²）被定義為由三個相鄰NK細胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區(qū)域邊界距離（μm）表示NK細胞質(zhì)心到最近腫瘤細胞區(qū)域邊界的距離。如距離為正，則NK細胞位于腫瘤細胞區(qū)域外部，如距離為負，則NK細胞位于腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)部。

 

對距腫瘤細胞區(qū)域不同距離的相鄰三個NK細胞間面積的分析表明，絕大部分相鄰NK細胞形成的三角形面積都在600μm²以下，且與腫瘤細胞區(qū)域邊界的距離都在±12μm的范圍內(nèi)。面積越小，證明NK細胞密度越高，而且都集中分布在腫瘤區(qū)域周圍。正如圖2中所看到的，NK細胞的分布受到腫瘤細胞區(qū)域的影響，絕大部分NK細胞都圍繞著腫瘤細胞區(qū)域（圖3）。

圖3:NK細胞密度與腫瘤細胞區(qū)域的關(guān)系。左：細胞圍成的三角形面積與細胞和腫瘤邊界之間距離的火山圖。縱軸：3個相鄰NK細胞圍城的三角形面積。橫軸：NK細胞中心與腫瘤邊界的距離。右：分布在腫瘤細胞區(qū)域附近的NK細胞數(shù)量，按不同距離進行分類

 

圖4中黃色標記區(qū)域為腫瘤細胞區(qū)域，品紅色標記CD8+ T細胞分布在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)部和外部。圖中大部分CD8+ T細胞集中在腫瘤細胞區(qū)域周圍，部分CD8+ T細胞在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)。

圖4:腫瘤細胞區(qū)域微環(huán)境中CD8+ T細胞簇的ROI和細節(jié)（腫瘤細胞區(qū)域用黃色標出，CD8+ T細胞呈品紅色；圖片由InnoQuant獲取，QuPath分析）

 

三個CD8+ T細胞間面積（μm²）被定義為由相鄰三個CD8+ T細胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區(qū)域邊界距離（μm）表示CD8+ T細胞質(zhì)心到最近腫瘤細胞區(qū)域邊界的距離。如距離為正，則CD8+ T細胞位于腫瘤細胞區(qū)域外部。如距離為負，則CD8+ T細胞位于腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)部。

 

對距腫瘤細胞區(qū)域不同距離的相鄰三個 CD8+ T 細胞間面積的分析表明，絕大部分相鄰CD8+ T細胞形成的三角形面積都在600μm²以下，且與腫瘤細胞區(qū)域邊界的距離都在±12um的范圍內(nèi)。面積越小，證明CD8+ T細胞密度越高，而且都集中分布在腫瘤區(qū)域周圍。說明正如圖4中所看到的，CD8+ T細胞的分布受到腫瘤細胞區(qū)域的影響，絕大部分CD8+ T細胞都圍繞著腫瘤細胞區(qū)域（圖5）。

圖5: CD8+ T細胞密度與腫瘤細胞區(qū)域的關(guān)系。左：細胞圍成的三角形面積與細胞和腫瘤邊界之間距離的火山圖。縱軸：3個相鄰CD8+ T細胞圍城的三角形面積。橫軸：CD8+ T細胞中心與腫瘤邊界的距離。右：分布在腫瘤細胞區(qū)域附近的CD8+ T細胞數(shù)量，按不同距離進行分類

 

 

無論是NK細胞還是CD8+ T細胞，都受到腫瘤區(qū)域的影響，集中分布在腫瘤細胞區(qū)域內(nèi)外，不斷浸潤腫瘤組織。

 

利用全組織掃描成像并結(jié)合深度學習算法，可以識別不同免疫細胞以及分析其與腫瘤區(qū)域的距離。本案例證明了InnoQuant提供的整張掃描圖像可以在第三方分析軟件中生成相關(guān)數(shù)據(jù)。圖像質(zhì)量高，可以得到如細胞計數(shù)和鄰近分析等統(tǒng)計學分析，以更好地了解患者的特定病理生理狀況。這些空間和定量的數(shù)據(jù)可用于進一步預測免疫腫瘤領(lǐng)域的治療反應。

Innopsys 成立于1999年�？偛课挥诜▏�，一直致力于生物醫(yī)學領(lǐng)域相關(guān)儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。InnoQuant組織切片/生物芯片掃描儀，采用先進的共聚焦PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時進行多通道熒光檢測。不僅掃描結(jié)果清晰，而且無需后續(xù)拼接和陰影校正處理，在組織切片和生物芯片掃描領(lǐng)域都有廣泛應用。

 

環(huán)亞生物，生命科學產(chǎn)品全國性代理商，具備完善的公司運營、產(chǎn)品管理、營銷、售前技術(shù)支持和售后維修體系。環(huán)亞生物作為InnoQuant大中華區(qū)代理商，負責InnoQuant產(chǎn)品大中華區(qū)的營銷和售后支持。

 

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