編者按

阿爾茲海默癥（AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知能力下降。神經(jīng)炎癥是AD的病理特征之一，主要由小膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)。為了研究年齡和APOE基因型對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，本文利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、可及性檢測(cè)和多重原位轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)技術(shù)，整合單細(xì)胞與空間組學(xué)數(shù)據(jù)，繪制了AD小膠質(zhì)細(xì)胞圖譜，鑒定出一種新的耗竭樣小膠質(zhì)細(xì)胞群體，解析其功能以及與AD進(jìn)展的關(guān)系。

01 研究背景

阿爾茲海默癥（AD）是一種無(wú)法治愈的神經(jīng)退行性疾病，其特征是進(jìn)行性突觸功能障礙、神經(jīng)元丟失和認(rèn)知能力下降。β 淀粉樣蛋白 (Aβ) 肽的過(guò)度積累和過(guò)度磷酸化tau蛋白的聚集是AD大腦的主要病理特征，其次是神經(jīng)炎癥，這被認(rèn)為主要是由小膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)。小膠質(zhì)細(xì)胞是經(jīng)典神經(jīng)炎癥的中心介質(zhì)，異質(zhì)性高，以不同的狀態(tài)存在于AD大腦中，可能對(duì)疾病進(jìn)展有利或有害，然而決定特定小膠質(zhì)細(xì)胞群是否限制或促進(jìn)AD病理的因素仍然不明確。為了表征AD腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的變化，本文對(duì)不同年齡和不同APOE基因型小鼠腦中免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性（ATAC）分析，結(jié)合多重原位轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)技術(shù)，系統(tǒng)地描繪了神經(jīng)免疫系統(tǒng)的復(fù)雜動(dòng)態(tài)，鑒定到一個(gè)新的炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞群體，并多角度解析其特征和對(duì)AD發(fā)展的影響。

02 文章詳情

文章題目：An exhausted-like microglial population accumulates in aged and APOE4 genotype Alzheimer's brains

中文題目：衰老和APOE4基因型阿爾茨海默癥大腦中積累了耗竭樣的小膠質(zhì)細(xì)胞群

發(fā)表時(shí)間：2024.01

期刊名稱：Immunity

影響因子：32.4

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序+ATAC+多重原位轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)

DOI：10.1016/j.immuni.2023.12.001

03 技術(shù)路線

為了方便各位老師快速掌握研究思路，小編繪制了文章的研究框架圖，供各位觀賞。

04 研究結(jié)果

1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在AD小鼠中鑒定到一個(gè)TIM細(xì)胞群

首先構(gòu)建攜帶有不同APOE等位基因的AD小鼠，并對(duì)10、20和96周小鼠的海馬和皮層組織進(jìn)行取樣、分選免疫細(xì)胞（CD45+）并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。細(xì)胞注釋后將其中的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行再聚類，發(fā)現(xiàn)一群高表達(dá)炎癥和早反應(yīng)基因的細(xì)胞，幾乎僅存在于96周小鼠中，且在APOE4基因型中比例高于APOE3基因型。速率算法發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)急性和慢性炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞群向這一群年齡特異性小膠質(zhì)細(xì)胞群流動(dòng)。因此，研究者將這群細(xì)胞命名為終末炎癥性小膠質(zhì)細(xì)胞（TIM）。TIM可分為兩個(gè)主要亞群，一個(gè)高表達(dá)效應(yīng)器marker（effector-hi TIM），另一個(gè)則高表達(dá)應(yīng)激marker（effector-lo TIM）。effector-lo TIM在APOE4基因型AD小鼠中比例更高，而effector-hi TIM在APOE2基因型小鼠中比例更高，說(shuō)明TIM的異質(zhì)性在AD環(huán)境中受APOE基因型調(diào)控。

Fig.1 年齡和APOE基因型依賴的AD神經(jīng)免疫圖譜

2. TIM在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞通訊和代謝方面的特征

利用SCENIC算法確認(rèn)TIM的驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)TIM與核因子(NF)-kB和CEB/P家族轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)的一系列炎癥調(diào)控因子以及多個(gè)AP-1家族轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。相對(duì)于穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞，TIM在一些炎癥調(diào)控因子（Nfkb2、Irf1、Irf3和Irf4）中富集，但在其他因子（Irf5、Irf7、Irf9和Stat1/2）中減少，表明可能有特定炎癥途徑的潛在選擇性調(diào)節(jié)。

利用CellPhoneDB分析小膠質(zhì)細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞間的通訊關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TIM表現(xiàn)出減少炎癥和降低激活的傾向。TIM中的TGF-β信號(hào)相對(duì)于疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞（DAM）和穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞減少，表明TIM通過(guò)其他機(jī)制獲得炎癥減輕的表型。此外，在微環(huán)境中，TIM促進(jìn)炎癥的能力減弱。

利用Compass分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能量代謝通路、糖酵解/糖異生途徑以及糖類的代謝通路在TIM中減少，而與活性氧（ROS）解毒和多種氨基酸代謝相關(guān)的通路在TIM中增加。

Fig.2 TIMs由獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄程序、相互作用和代謝狀態(tài)定義

3. 單細(xì)胞多組學(xué)揭示TIM轉(zhuǎn)錄調(diào)控的介質(zhì)

為了補(bǔ)充從20到96周齡小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育特征，并且從轉(zhuǎn)錄組和轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩個(gè)組學(xué)來(lái)表征小膠質(zhì)細(xì)胞，研究者利用單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組和ATAC檢測(cè)技術(shù)分析60周齡AD小鼠海馬和皮層組織的免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞亞群表達(dá)模式與TIM相似，其比例高于20周齡小鼠，低于96周齡小鼠，說(shuō)明TIM在60周齡時(shí)已經(jīng)以較高水平可檢測(cè)，并且隨后以年齡依賴的方式繼續(xù)積累。TIM的marker基因在表達(dá)和可及性方面具有高度一致性。對(duì)ATAC結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ETS轉(zhuǎn)錄因子家族特異性富集于TIM中。此外，SCENIC+、CellPhoneDB和Compass的分析結(jié)果表明，60周齡與96周齡的TIM在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞互作和代謝上特征一致。

Fig.3 60周齡AD*APOE4小鼠的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+ATAC測(cè)序表明TIMs的調(diào)控特征

4. TIM存在于晚期AD患者中，并隨著年齡和APOE4增加而增多

為了確認(rèn)在小鼠中發(fā)現(xiàn)的TIM是否真實(shí)存在于人腦中，研究者對(duì)已發(fā)表的人腦單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分析，并成功鑒定到TIM的存在，在AD患者中比例高于健康人，并隨著布雷克分級(jí)（衡量AD進(jìn)展的組織病理學(xué)指標(biāo)）增加而增加。攜帶APOE4等位基因的患者比APOE3/APOE3患者的TIM比例更高。建模分析表明，布雷克分級(jí)和APOE4等位基因計(jì)數(shù)是TIM比例的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子。在一個(gè)小鼠跨年齡單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜中發(fā)現(xiàn)TIM的比例隨年齡增加而增加。

Fig.4 TIM存在于公開(kāi)的人單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)集

5. 腦皮層中TIM分布區(qū)域富含Aβ斑塊和炎性細(xì)胞

為了確認(rèn)空間水平上TIM的分布特征，研究者利用多重原位轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)技術(shù)對(duì)6位AD患者（3位APOE4純合子和3位APOE3純合子）切片進(jìn)行分析。其中，APOE4純合子中TIM比例更高，空間鄰域分析發(fā)現(xiàn)TIM與TIM、L5神經(jīng)元和兩種特定的星形膠質(zhì)細(xì)胞相鄰概率更高。APOE4中的 TIM 更有可能與神經(jīng)元和這兩個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞群聚集，而APOE3 中的 TIM 更可能與少突膠質(zhì)細(xì)胞（多數(shù)位于白質(zhì)中）相鄰，說(shuō)明APOE4基因型與 TIM比例增加以及這些TIM與灰質(zhì)更接近相關(guān)。此外，在含有高Aβ的區(qū)域中檢測(cè)到TIM，表明 TIM 在Aβ相關(guān)發(fā)病機(jī)制中具有潛在作用。

Fig.5 TIM富集在攜帶 APOE4 的AD 患者的皮質(zhì)層中

6. TIM的Aβ吞噬和清除能力缺陷

接下來(lái)，研究者將60周齡不同APOE基因型的AD小鼠海馬和皮層中的細(xì)胞與熒光標(biāo)記的Aβ體外共培養(yǎng)、分選（CD45+），并根據(jù)熒光信號(hào)高低分為2管（熒光信號(hào)高說(shuō)明細(xì)胞吸收Aβ的量高，反之則低），進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果表明，Aβ吸收少的細(xì)胞群體向TIM靠攏，Aβ吸收高的細(xì)胞群體中effector-lo和effector-hi TIM比例低，且在APOE4基因型中effector-lo更低，說(shuō)明該基因型中該細(xì)胞群體的 Aβ 清除缺陷更加嚴(yán)重，導(dǎo)致該基因型患者負(fù)擔(dān)更重的復(fù)合效應(yīng)。

Fig.6 TIM的Aβ清除功能受損

7. 阿杜那單抗治療可調(diào)節(jié) TIM 的比例和相互作用

阿杜那單抗通過(guò)選擇性結(jié)合Aβ聚合體來(lái)減緩疾病進(jìn)展。為了剖析該藥物如何影響晚期疾病中TIMs的出現(xiàn)和行為，研究者給60周齡的AD小鼠注射阿杜那單抗或同種型對(duì)照并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)effector-hi TIM在藥物處理組比例更高，而effector-lo TIM在對(duì)照組比例更高�；プ鞣治霭l(fā)現(xiàn)阿杜那單抗治療和 APOE4 均與預(yù)測(cè)的相互作用更多和平均預(yù)測(cè)相互作用強(qiáng)度越高相關(guān)，阿杜那單抗治療在APOE2中較難驅(qū)動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的反應(yīng)，而在APOE3/4中則相反。在免疫細(xì)胞互作關(guān)系中，治療作用顯著增加了適應(yīng)性免疫細(xì)胞總相互作用，且在APOE4中增加更多。與B和T細(xì)胞的互作信號(hào)中，信號(hào)增長(zhǎng)最大的是effector-hi TIM，表明這種細(xì)胞在協(xié)調(diào)炎癥期間的細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)時(shí)可能特別關(guān)鍵，effector-hi TIM可能是對(duì)aducanumab治療的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的中心協(xié)調(diào)者。

Fig.7 阿杜那單抗治療深刻改變了AD環(huán)境中免疫細(xì)胞的格局

05 主要結(jié)論

本研究在攜帶三種常見(jiàn)人 APOE 等位基因的AD模型小鼠中生成了腦免疫細(xì)胞的綜合縱向單細(xì)胞圖譜。轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性分析確定了一個(gè)反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞群體，其表達(dá)炎癥信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)在應(yīng)激marker，比例隨著年齡和 APOE4 負(fù)擔(dān)而增加。使用多重原位轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在AD患者的大腦中檢測(cè)到類似的群體，包括在皮質(zhì)組織中。這一群體被命名為終末炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞 (TIM)，在阿杜那單抗治療期間表現(xiàn)出Aβ清除缺陷和細(xì)胞間通訊改變。TIM 可能代表 AD 環(huán)境中炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞的類耗竭狀態(tài)，導(dǎo)致APOE4攜帶者和老年人的 AD 風(fēng)險(xiǎn)和病理，從而為 AD 提供潛在的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Millet, Alon et al. “An exhausted-like microglial population accumulates in aged and APOE4 genotype Alzheimer's brains.” Immunity vol. 57,1 (2024): 153-170.e6.