01  概述 Summary

CarboMAX 是一種創(chuàng)新的專禾刂偶聯(lián)技術(shù)，專為高溫下的肽鏈合成而設(shè)計(jì)。該技術(shù)相較于現(xiàn)行的碳二亞胺方法，提供了更快的反應(yīng)激活速度，和減少相應(yīng)的外消旋化，從而顯著提升了合成效率。此外，CarboMAX 在高溫條件下增強(qiáng)了對(duì)酸敏感連接物的穩(wěn)定性，特別對(duì)于磷酸肽、糖肽的合成，以及在超酸敏感鏈接劑上進(jìn)行肽鏈合成時(shí)，這一特性尤其有利。

02  引言 Introduction

近期研究表明，在 90°C 的條件下，利用高效固相肽合成過(guò)程（HE-SPPS）進(jìn)行的原位碳二亞胺激活可以實(shí)現(xiàn)快速且高效的肽偶聯(lián)。HE-SPPS 避免了使用基于季銨鹽的方法（例如 HCTU 和 HATU）時(shí)所需的大量強(qiáng)堿，從而減少了顯著的外消旋化問(wèn)題（特別是對(duì)于半胱氨酸），以及由于d-內(nèi)酰胺形成而導(dǎo)致的精氨酸缺失。CarboMAX 偶聯(lián)方法通過(guò)對(duì)現(xiàn)有碳二亞胺方法的兩個(gè)主要改進(jìn)，進(jìn)一步提升了合成效果：

(i) 提升粗制品純度與減少外消旋化：

CarboMAX 通過(guò)提高相對(duì)于氨基酸的碳二亞胺用量（2當(dāng)量），加速了必要的O-�；�異脲激活中間體的形成，這一過(guò)程在碳二亞胺激活中通常較為緩慢。O-�；�異脲形成的速率增加，使得偶聯(lián)步驟早期即可獲得更多的激活氨基酸。因此，實(shí)現(xiàn)了更快的偶聯(lián)速度，并相應(yīng)地降低了外消旋化的發(fā)生。在眾多實(shí)例中，CarboMAX 的應(yīng)用顯著提升了粗制品的純度。

(ii) 避免酸敏感官能團(tuán)/接頭的非期望裂解：

與碳二亞胺化學(xué)反應(yīng)配合使用的激活劑（如Oxyma Pure）具有酸性，可能在高溫下過(guò)早地移除酸敏感基團(tuán)。CarboMAX 方法通過(guò)使用少量的堿（相對(duì)于激活氨基酸 0.4 當(dāng)量的 DIEA）來(lái)穩(wěn)定這些酸敏感連接體。這些堿的用量足夠低，不會(huì)干擾激活過(guò)程，同時(shí)保持外消旋化降至蕞低。

03 材料與方法 Materials and Methods

試劑

所有標(biāo)準(zhǔn)的 Fmoc 氨基酸均購(gòu)自 CEM 公司（位于北卡羅來(lái)納州的馬修斯），包含以下側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)：Arg(Pbf)，Asn(Trt)，Asp(OMpe)，Cys(Trt)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，His(Trt)，Lys(Boc)，Ser(tBu)，Thr(tBu)，Trp(Boc)和Tyr(tBu)。磷酸化氨基酸 Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)-OH，Oxyma Pure 以及 Rink Amide ProTideTM LL 樹(shù)脂也購(gòu)自 CEM 公司（位于北卡羅來(lái)納州的馬修斯）。Fmoc-Thr(β-D-GlcNAc(Ac)₃)-OH和Fmoc-Lys(palmitoyl-Glu-OtBu)-OH 購(gòu)自 Bachem（瑞士）。N,N-二異丙基碳二亞胺（DIC），N,N-二異丙基乙胺（DIEA），哌啶，三氟乙酉夋（TFA），3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（DODT），三異丙基硅烷（TIS）和乙酸購(gòu)自 Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）。二氯甲烷（DCM），N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和無(wú)水乙酉迷（Et₂O）購(gòu)自VWR（賓夕法尼亞州西切斯特）。HPLC級(jí)水（H₂O）和HPLC級(jí)乙腈（MeCN）購(gòu)自Fisher Scientific（馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。

肽合成

肽的制備采用 0.05 或 0.1 毫摩爾規(guī)模，使用 CEM Liberty Blue™ 自動(dòng)化微波肽合成儀，在 0.18 毫摩爾/克的 Rink Amide ProTide LL 樹(shù)脂（CEM零件號(hào)R002）上進(jìn)行，除非另有說(shuō)明。去保護(hù)反應(yīng)使用含有20% 哌啶的 DMF 進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)使用 5 當(dāng)量的氨基酸，以 Fmoc-AA-OH/DIC/Oxyma Pure 在 DMF 中進(jìn)行。切割步驟使用 CEM Razor 高通量肽切割系統(tǒng)，在升高的溫度下用 TFA/H₂O/TIS/DODT 進(jìn)行 30 分鐘。切割后，肽在冷乙酉迷中沉淀并過(guò)夜凍干。

肽分析

肽的分析在配備有 PDA 檢測(cè)器的 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)上進(jìn)行，該系統(tǒng)裝配了 Acquity UPLC BEH C8 柱（1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統(tǒng)連接到 Waters 3100 Single Quad MS 以進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。峰分析通過(guò) Waters MassLynx 軟件實(shí)現(xiàn)。分離采用含有0.05% TFA 的 (i) H₂O 和 (ii) MeCN 的梯度洗脫進(jìn)行。

04 結(jié)果 Results

通過(guò)采用 CarboMAX 策略（即相對(duì)于氨基酸使用 2 當(dāng)量的 DIC），相較于傳統(tǒng)的 1 當(dāng)量使用，顯著提升了肽的純度。

這一改進(jìn)在 8 種矢口名肽的合成過(guò)程中得到了驗(yàn)證，這些肽分別采用了標(biāo)準(zhǔn)碳二亞胺化學(xué)方法和 CarboMAX 策略進(jìn)行合成（見(jiàn)表1；圖1至6）。關(guān)鍵的是，在使用過(guò)量碳二亞胺的過(guò)程中，并未發(fā)現(xiàn)不良封端現(xiàn)象。

表1. 通過(guò)應(yīng)用 CarboMAX 偶聯(lián)方法改善了肽的純度

*用~0.32 mmol/g Fmoc-Gly-Wang PS樹(shù)脂合成

通過(guò)優(yōu)化O-�；�異脲的形成過(guò)程，CarboMAX 技術(shù)能夠迅速供應(yīng)更高濃度的活性氨基酸。這一優(yōu)勢(shì)對(duì)于縮短敏感酯類物質(zhì)在后續(xù)�；�反應(yīng)前的存活時(shí)間至關(guān)重要。為了證實(shí)此效果，研究人員采用了水解、繼之衍生化以及氣相色譜（由 C.A.T. GmbH 執(zhí)行）等手段，對(duì) Liraglutide 序列中各氨基酸的差向異構(gòu)水平進(jìn)行了深入分析。表 2 的數(shù)據(jù)明顯顯示，在使用 CarboMAX 的過(guò)程中觀察到的差向異構(gòu)現(xiàn)象有減少的趨勢(shì)，從而佐證了加速O-酰基異脲生成的理論。因此，相較于以往描述的任何高溫偶聯(lián)方法，CarboMAX 偶聯(lián)技術(shù)憑借其提升的偶聯(lián)效率和降低的差向異構(gòu)率，實(shí)現(xiàn)了更佳的粗制品純度。

表2. 利拉魯肽的差向異構(gòu)化水平

 

CarboMAX 策略的一個(gè)可選優(yōu)化是在氨基酸反應(yīng)中采用 0.4 當(dāng)量的堿。這一調(diào)整確保了在整個(gè)激活和偶聯(lián)過(guò)程中，DIEA（N,N-二異丙基乙胺）以催化量存在，有效地穩(wěn)固了酸敏感鍵合（詳見(jiàn)表 3）。該優(yōu)化最初通過(guò)應(yīng)用超酸敏感樹(shù)脂鏈接劑進(jìn)行了驗(yàn)證。在肽合成領(lǐng)域，運(yùn)用諸如2-Cl-三苯甲基、三苯甲基（Trt）以及 Cl-TCP 這類超酸敏感鏈接劑至關(guān)重要，它們促進(jìn)了受保護(hù)的肽段的縮合，防止了二酮哌口秦生成，規(guī)避了在樹(shù)脂裝載時(shí)的DMAP使用，并顯著減少了 C 端半胱氨酸殘基發(fā)生β消去的風(fēng)險(xiǎn)。

在 90°C 條件下，采用 DIC/Oxyma Pure 進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)碳二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)僅進(jìn)行了 2 分鐘，這導(dǎo)致了在三苯甲基樹(shù)脂連接劑上合成 ACP 肽的產(chǎn)率不盡人意。不過(guò)，當(dāng)反應(yīng)中加入了 0.1 當(dāng)量的 DIEA 并在同樣的高溫下實(shí)施 CarboMAX 偶聯(lián)策略時(shí)，不僅保護(hù)了三苯甲基連接劑的鍵穩(wěn)定性，還成功地將產(chǎn)率顯著提升，從原先的 38% 躍升至 96%。這一顯著的提升彰顯了 CarboMAX 偶聯(lián)方法在提高肽合成效率方面的優(yōu)越性。

表3. 使用高酸敏感型 Fmoc-Gly-NovaSyn TGT 樹(shù)脂合成ACP

^65-74ACP: VQAAIDYING

在高溫條件下，涉及磷酸氨基酸衍生物的合成反應(yīng)面臨著由β-消除引起的磷酰基團(tuán)丟失的風(fēng)險(xiǎn)，這種風(fēng)險(xiǎn)在去保護(hù)和酸性切割過(guò)程中尤為顯著。此外，一旦磷酸氨基酸被引入到序列中，它所產(chǎn)生的顯著空間位阻會(huì)使得后續(xù)殘基的偶聯(lián)變得異常困難。采用 CarboMAX 偶聯(lián)方法并配合 0.4 當(dāng)量的 DIEA，研究成功合成了以 3 個(gè)磷酸氨基酸殘基為主的目標(biāo)磷酸肽，如圖 7a 所展示的成果。與此形成鮮明對(duì)比的是，未添加 DIEA 的合成實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)到目標(biāo)肽的存在（圖 7b）。

TpTGNGKPVECpSQPESSFKMpSFKR

圖7a. 使用 UPLC-MS 分析粗磷酸肽 0.4 等效 DIEA （CarboMAX）

圖7b. 粗磷酸肽的 UPLC-MS 分析（標(biāo)準(zhǔn)品）

 

此外，O-連接的糖基氨基酸含有可能在高溫碳二亞胺偶聯(lián)過(guò)程中斷裂的敏感鍵。通過(guò)采用 CarboMAX 偶聯(lián)技術(shù)并添加 0.4 當(dāng)量的 DIEA，實(shí)現(xiàn)了 MUC-1 糖肽的合成，粗品純度高達(dá) 72%，如圖 8 所示。值得一提的是，CarboMAX 方法僅需要使用 2 當(dāng)量的糖基氨基酸過(guò)量，這在考慮到糖基化氨基酸昂貴成本的情況下，顯著降低了材料費(fèi)用，經(jīng)濟(jì)效益顯著。

PAHGVT[β-D-GlcNAc(Ac)₃]SAPDTRPAPGSTAP

圖8. 使用 UPLC-MS 分析粗 MUC-1 糖肽 0.4 等效 DIEA （CarboMAX）

05 結(jié)論 Conclusion

CarboMAX 方法通過(guò)微波輔助的固相肽合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)了更快的偶聯(lián)反應(yīng)和較低的差向異構(gòu)化。對(duì)于昂貴或難以合成的氨基酸殘基，僅需使用 2 當(dāng)量即可有效進(jìn)行偶聯(lián)。此外，可選地加入催化量的 DIEA（0.4 當(dāng)量），有助于在高溫條件下預(yù)防酸敏感鍵的不必要斷裂，從而保護(hù)了肽鏈的完整性。

引用 References

(1) J. Collins, K. Porter, S. Singh and G. Vanier, “High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS),” Org. Lett., vol. 16, pp. 940-943, 2014.

(2) Patent Pending: US15686719; EP17188963.7

(3) Patent Pending: US20160176918; EP3037430;JP2016138090; CN105713066; AU2017204172