建立共培養(yǎng)血腦屏障模型以了解其對血腦屏障完整性的影響
大腦的穩(wěn)態(tài)由一種稱為血腦屏障（BBB）的特殊結構維持。BBB 是一種復雜的三維結構，由腦微血管內皮細胞、星形膠質細胞和周細胞組成。星形膠質細胞突起末端形成膨大的終足，包圍著內皮細胞，被認為有助于維持血腦屏障。這種復合物的屏障性質由特化的腦內皮細胞維持，形成緊密的連接復合體，包括緊密連接和粘附連接。
BBB 的正常功能對于中樞神經系統(tǒng)（CNS）的正常和調節(jié)功能至關重要。多項研究表明，BBB 的破壞與阿爾茨海默病（AD）的發(fā)生有關。此外，神經炎癥已被證明會損害 BBB 并導致 AD 的進一步發(fā)展。已知幾種外周代謝紊亂，如高血糖癥、糖尿病和心血管疾病，是導致血腦屏障破壞的原因，也會對 BBB 的完整性提出挑戰(zhàn)。
由于 BBB 在神經系統(tǒng)疾病和藥理學研究中的關鍵作用，BBB 模型是必不可少的組成部分。目前，已經開發(fā)了幾種 BBB 模型，從單培養(yǎng)模型到共培養(yǎng)模型到更復雜的模型，如使用動物和人類細胞類型的球體和芯片模型。復雜的模型使用細胞的 3D 組織來代表 BBB 結構，并模擬腦血流。盡管有這些優(yōu)點，但它們很難設置，重要的是，價格昂貴。因此，Transwell 小室共培養(yǎng)系統(tǒng)提供了一種更簡單、更具成本效益和功能性的 BBB 模型。在韓國慶尚國立大學應用生命科學系、荷蘭馬斯特里赫特大學精神病學和神經心理學系課題組的一項研究中，描述了一種接觸式共培養(yǎng)體外模型，使用小鼠腦內皮細胞系和星形膠質細胞系在小室培養(yǎng)，該系統(tǒng)為各種神經學研究場景提供了一個兼具高效性和功能性的平臺。研究成果發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“Establishing Co-Culture Blood-Brain Barrier Models for Different Neurodegeneration Conditions to Understand Its Effect on BBB Integrity”。
首先，將腦微血管內皮細胞系 bEnd.3 和星形膠質細胞系 C8-D1A 在小室中進行接觸共培養(yǎng)，內皮細胞培養(yǎng)在頂部，而 C8-D1A 細胞接種在小室的基底外側（圖1 A-C）。粘附在膜兩側的細胞通過膜的微孔利用突出的終足顯示出細胞間通訊。電子顯微鏡圖像顯示星形膠質細胞終足穿過孔膜的證據（圖1 D、F）。該特性模擬了實際的 BBB，其中星形膠質細胞終足與內皮細胞接觸（圖1 F）。
在建立共培養(yǎng)的BBB模型后，實驗檢測了其屏障功能和性能。首先，分析單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的 C8-D1A 和 bEnd.3 細胞的跨膜電阻值（TEER）值。TEER 值是膜滲透性的一個重要指標，滲透性越高 TEER 越低，它的變化能夠反映膜的緊密連接功能。結果表明，共培養(yǎng)比單培養(yǎng)顯示出更高的 TEER 值。此外，由于細胞的融合性，TEER 值隨時間推移而增加，表明與單獨培養(yǎng)的細胞相比，transwell 共培養(yǎng)顯示出zui大的抗?jié)B透性。因此，共培養(yǎng)的 BBB 模型可顯示出有效的屏障功能和性能，說明目前的體外共培養(yǎng)模型可表征完整 BBB 特征。
然后，在單（不含 C8-D1A）和共（含 C8-D1A）培養(yǎng)模型中分析 ZO-1、occludin-1 和 caludin-5 等緊密連接蛋白的表達，以評估細胞間粘附。Western blot 分析表明，共培養(yǎng)模型中所有上述緊密連接蛋白的表達量都比單培養(yǎng)模型高 1.5-2 倍（圖2 A）。此外，熒光免疫組化分析驗證了這一發(fā)現(xiàn)，與單培養(yǎng)模型相比，共培養(yǎng)模型中的 ZO-1 表達增強（圖2 B）。這說明，共培養(yǎng)模型顯示出增強的細胞間粘附。
接下來，將 PA-BSA（牛血清白蛋白偶聯(lián)棕櫚酸）暴露于共培養(yǎng)模型 24h 來建立體外肥胖模型。免疫熒光結果顯示，ZO-1水平顯著下降。蛋白質印跡分析顯示，緊密連接蛋白，包括 ZO-1、occludin-1 和 claudin-5 在 PA-BSA 處理的細胞中表達水平也顯著下降。此外，通過測量 BBB 兩端的電阻，分析了 PA-BSA 對 BBB 完整性的惡化影響。TEER 分析進一步證實了 PA-BSA 暴露顯著破壞了 BBB 的電阻，從而表明 BBB 結構減弱。這說明，暴露于棕櫚酸會模擬肥胖并破壞 BBB 的緊密連接。
神經炎癥的特征包括負責分泌白細胞介素和細胞因子的小膠質細胞的激活。為了模擬這種情況，將共培養(yǎng)模型暴露于富含促炎白細胞介素和細胞因子的小膠質細胞條件培養(yǎng)基（MCM）。免疫熒光分析顯示，與對照組相比，MCM 組的 ZO-1 表達下降，星形膠質細胞損傷標志物膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達顯著增加（圖3 A、B）。通過蛋白質印跡驗證了這一發(fā)現(xiàn)，與未暴露的對照組相比，MCM 暴露后緊密連接蛋白的水平顯著下降，而 GFAP 表達增加（圖3 C、D）。
使用TEER分析了 BBB 完整性，發(fā)現(xiàn)暴露于 MCM 后屏障能力迅速下降（圖3 E）。這說明，神經炎癥影響血腦屏障通透性的下降。
目前，普遍認為 β-淀粉樣蛋白（Aβ）是構成 AD 主要病理特征，在細胞基質沉淀聚積后具有很強的神經毒性作用。研究人員使用 bEnd.3 細胞（頂部）、C8-D1A 細胞（基底膜外側）和 HT22 細胞（下室），創(chuàng)建了具有三種共培養(yǎng)細胞系的 AD 樣病理學的體外模型。HT22 細胞用淀粉樣前體蛋白過表達質粒 pCAX APPswe/ind 轉染或暴露于溶解在培養(yǎng)基中的 Aβ（1-42）多肽中進行 TEER 分析以檢測 Aβ 毒性的作用。
與對照組相比，單培養(yǎng)模型中 ZO-1 表達水平在暴露于 Aβ 的細胞數量中顯著降低（圖4 A）。此外，單培養(yǎng)模型中的緊密連接蛋白表達水平也顯著下調（圖4 B）。在暴露于 Aβ 的共培養(yǎng)模型中，TEER 分析也顯示屏障功能迅速下降（圖4 C），且緊密連接蛋白表達顯示出相似的下降趨勢（圖4 D）。Aβ 注射小鼠額葉皮層和海馬區(qū)的 Western blot 分析顯示，ZO-1 蛋白表達水平明顯低于對照組（圖4 E）。Aβ 共定位在特定的大腦區(qū)域，這證實了 Aβ 的毒性，以及在 Aβ 誘導的 AD 模型中觀察到的緊密連接蛋白表達水平。這些數據表明，β淀粉樣蛋白病理學導致血腦屏障破壞。
在這項研究中，開發(fā)了一種結合腦內皮細胞（bEnd.3）和星形膠質細胞（C8-D1A）的 transwell 共培養(yǎng)模型�？傮w而言，與僅內皮細胞模型（單培養(yǎng)）相比，共培養(yǎng)模型顯示出更好的 BBB 結構和功能完整性，以及更高的緊密連接蛋白水平。此外，共培養(yǎng)模型表明，一旦暴露于上述疾病環(huán)境，其完整性和緊密連接蛋白水平就會降低。
該研究建立的體外模型，包括對物理特性、滲透性、TEER 評估和緊密連接蛋白的表達分析，而且已被用于模擬不同的大腦狀況。研究人員證明，該模型是一種出色的體外血腦屏障模型，可應用于與血腦屏障完整性相關的多種疾病研究。未來，將可以作為研究復雜生理狀況的便捷工具，以及治療多種神經系統(tǒng)疾病的藥物作用模型，如阿爾茨海默病、帕金森病、缺血、TBI和腦代謝紊亂。
參考文獻：Park JS, Choe K, Khan A, Jo MH, Park HY, Kang MH, Park TJ, Kim MO. Establishing Co-Culture Blood-Brain Barrier Models for Different Neurodegeneration Conditions to Understand Its Effect on BBB Integrity. Int J Mol Sci. 2023 Mar 9;24(6):5283. doi: 10.3390/ijms24065283. PMID: 36982361; PMCID: PMC10049378.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36982361/
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BBB 的正常功能對于中樞神經系統(tǒng)（CNS）的正常和調節(jié)功能至關重要。多項研究表明，BBB 的破壞與阿爾茨海默病（AD）的發(fā)生有關。此外，神經炎癥已被證明會損害 BBB 并導致 AD 的進一步發(fā)展。已知幾種外周代謝紊亂，如高血糖癥、糖尿病和心血管疾病，是導致血腦屏障破壞的原因，也會對 BBB 的完整性提出挑戰(zhàn)。
由于 BBB 在神經系統(tǒng)疾病和藥理學研究中的關鍵作用，BBB 模型是必不可少的組成部分。目前，已經開發(fā)了幾種 BBB 模型，從單培養(yǎng)模型到共培養(yǎng)模型到更復雜的模型，如使用動物和人類細胞類型的球體和芯片模型。復雜的模型使用細胞的 3D 組織來代表 BBB 結構，并模擬腦血流。盡管有這些優(yōu)點，但它們很難設置，重要的是，價格昂貴。因此，Transwell 小室共培養(yǎng)系統(tǒng)提供了一種更簡單、更具成本效益和功能性的 BBB 模型。在韓國慶尚國立大學應用生命科學系、荷蘭馬斯特里赫特大學精神病學和神經心理學系課題組的一項研究中，描述了一種接觸式共培養(yǎng)體外模型，使用小鼠腦內皮細胞系和星形膠質細胞系在小室培養(yǎng)，該系統(tǒng)為各種神經學研究場景提供了一個兼具高效性和功能性的平臺。研究成果發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“Establishing Co-Culture Blood-Brain Barrier Models for Different Neurodegeneration Conditions to Understand Its Effect on BBB Integrity”。
首先，將腦微血管內皮細胞系 bEnd.3 和星形膠質細胞系 C8-D1A 在小室中進行接觸共培養(yǎng)，內皮細胞培養(yǎng)在頂部，而 C8-D1A 細胞接種在小室的基底外側（圖1 A-C）。粘附在膜兩側的細胞通過膜的微孔利用突出的終足顯示出細胞間通訊。電子顯微鏡圖像顯示星形膠質細胞終足穿過孔膜的證據（圖1 D、F）。該特性模擬了實際的 BBB，其中星形膠質細胞終足與內皮細胞接觸（圖1 F）。
圖1 建立BBB模型的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。
（A）時間線示意圖代表bEnd.3 和 C8-D1A 細胞在小室的頂端和基底外側接種以獲得體外接觸共培養(yǎng) BBB 模型。（B）體外完整接觸共培養(yǎng)BBB模型的圖示。（C）蘇木精和伊紅（H&E）染色的transwell 膜顯示在頂端和基底外側粘附的 bEnd.3 和 C8-D1A 細胞。（D-F）掃描電子顯微照片顯示bEnd.3 細胞和C8-D1A 細胞，放大顯微照片顯示基底外側的 C8-D1A 細胞終足穿過 0.4 μm 孔（白色箭頭）到達transwell膜頂端的 bEnd.3 細胞。在建立共培養(yǎng)的BBB模型后，實驗檢測了其屏障功能和性能。首先，分析單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的 C8-D1A 和 bEnd.3 細胞的跨膜電阻值（TEER）值。TEER 值是膜滲透性的一個重要指標，滲透性越高 TEER 越低，它的變化能夠反映膜的緊密連接功能。結果表明，共培養(yǎng)比單培養(yǎng)顯示出更高的 TEER 值。此外，由于細胞的融合性，TEER 值隨時間推移而增加，表明與單獨培養(yǎng)的細胞相比，transwell 共培養(yǎng)顯示出zui大的抗?jié)B透性。因此，共培養(yǎng)的 BBB 模型可顯示出有效的屏障功能和性能，說明目前的體外共培養(yǎng)模型可表征完整 BBB 特征。
然后，在單（不含 C8-D1A）和共（含 C8-D1A）培養(yǎng)模型中分析 ZO-1、occludin-1 和 caludin-5 等緊密連接蛋白的表達，以評估細胞間粘附。Western blot 分析表明，共培養(yǎng)模型中所有上述緊密連接蛋白的表達量都比單培養(yǎng)模型高 1.5-2 倍（圖2 A）。此外，熒光免疫組化分析驗證了這一發(fā)現(xiàn)，與單培養(yǎng)模型相比，共培養(yǎng)模型中的 ZO-1 表達增強（圖2 B）。這說明，共培養(yǎng)模型顯示出增強的細胞間粘附。
圖2 共培養(yǎng)中腦內皮細胞表現(xiàn)出增強的緊密連接蛋白表達。
接下來，將 PA-BSA（牛血清白蛋白偶聯(lián)棕櫚酸）暴露于共培養(yǎng)模型 24h 來建立體外肥胖模型。免疫熒光結果顯示，ZO-1水平顯著下降。蛋白質印跡分析顯示，緊密連接蛋白，包括 ZO-1、occludin-1 和 claudin-5 在 PA-BSA 處理的細胞中表達水平也顯著下降。此外，通過測量 BBB 兩端的電阻，分析了 PA-BSA 對 BBB 完整性的惡化影響。TEER 分析進一步證實了 PA-BSA 暴露顯著破壞了 BBB 的電阻，從而表明 BBB 結構減弱。這說明，暴露于棕櫚酸會模擬肥胖并破壞 BBB 的緊密連接。
神經炎癥的特征包括負責分泌白細胞介素和細胞因子的小膠質細胞的激活。為了模擬這種情況，將共培養(yǎng)模型暴露于富含促炎白細胞介素和細胞因子的小膠質細胞條件培養(yǎng)基（MCM）。免疫熒光分析顯示，與對照組相比，MCM 組的 ZO-1 表達下降，星形膠質細胞損傷標志物膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達顯著增加（圖3 A、B）。通過蛋白質印跡驗證了這一發(fā)現(xiàn)，與未暴露的對照組相比，MCM 暴露后緊密連接蛋白的水平顯著下降，而 GFAP 表達增加（圖3 C、D）。
使用TEER分析了 BBB 完整性，發(fā)現(xiàn)暴露于 MCM 后屏障能力迅速下降（圖3 E）。這說明，神經炎癥影響血腦屏障通透性的下降。
圖3 促炎反應對血腦屏障的影響。
目前，普遍認為 β-淀粉樣蛋白（Aβ）是構成 AD 主要病理特征，在細胞基質沉淀聚積后具有很強的神經毒性作用。研究人員使用 bEnd.3 細胞（頂部）、C8-D1A 細胞（基底膜外側）和 HT22 細胞（下室），創(chuàng)建了具有三種共培養(yǎng)細胞系的 AD 樣病理學的體外模型。HT22 細胞用淀粉樣前體蛋白過表達質粒 pCAX APPswe/ind 轉染或暴露于溶解在培養(yǎng)基中的 Aβ（1-42）多肽中進行 TEER 分析以檢測 Aβ 毒性的作用。
與對照組相比，單培養(yǎng)模型中 ZO-1 表達水平在暴露于 Aβ 的細胞數量中顯著降低（圖4 A）。此外，單培養(yǎng)模型中的緊密連接蛋白表達水平也顯著下調（圖4 B）。在暴露于 Aβ 的共培養(yǎng)模型中，TEER 分析也顯示屏障功能迅速下降（圖4 C），且緊密連接蛋白表達顯示出相似的下降趨勢（圖4 D）。Aβ 注射小鼠額葉皮層和海馬區(qū)的 Western blot 分析顯示，ZO-1 蛋白表達水平明顯低于對照組（圖4 E）。Aβ 共定位在特定的大腦區(qū)域，這證實了 Aβ 的毒性，以及在 Aβ 誘導的 AD 模型中觀察到的緊密連接蛋白表達水平。這些數據表明，β淀粉樣蛋白病理學導致血腦屏障破壞。
圖4 淀粉樣蛋白對腦內皮細胞和星形膠質細胞的毒性。
在這項研究中，開發(fā)了一種結合腦內皮細胞（bEnd.3）和星形膠質細胞（C8-D1A）的 transwell 共培養(yǎng)模型�？傮w而言，與僅內皮細胞模型（單培養(yǎng)）相比，共培養(yǎng)模型顯示出更好的 BBB 結構和功能完整性，以及更高的緊密連接蛋白水平。此外，共培養(yǎng)模型表明，一旦暴露于上述疾病環(huán)境，其完整性和緊密連接蛋白水平就會降低。
該研究建立的體外模型，包括對物理特性、滲透性、TEER 評估和緊密連接蛋白的表達分析，而且已被用于模擬不同的大腦狀況。研究人員證明，該模型是一種出色的體外血腦屏障模型，可應用于與血腦屏障完整性相關的多種疾病研究。未來，將可以作為研究復雜生理狀況的便捷工具，以及治療多種神經系統(tǒng)疾病的藥物作用模型，如阿爾茨海默病、帕金森病、缺血、TBI和腦代謝紊亂。
參考文獻：Park JS, Choe K, Khan A, Jo MH, Park HY, Kang MH, Park TJ, Kim MO. Establishing Co-Culture Blood-Brain Barrier Models for Different Neurodegeneration Conditions to Understand Its Effect on BBB Integrity. Int J Mol Sci. 2023 Mar 9;24(6):5283. doi: 10.3390/ijms24065283. PMID: 36982361; PMCID: PMC10049378.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36982361/
圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關注!進入官網www.naturethink.com或關注"Naturethink"公眾號，了解更多相關內容。
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