摘要：聚糖通過碳水化合物-蛋白質(zhì)相互作用介導(dǎo)各種生物過程，聚糖微陣列已成為理解這些機(jī)制不可或缺的工具。 然而，由于缺乏從糖復(fù)合物中獲得具有不同結(jié)構(gòu)的天然聚糖文庫(kù)方便且通用的方法，功能糖組學(xué)的進(jìn)展受到阻礙。 為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，中國(guó)一研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種方法，可以對(duì)N/O-聚糖進(jìn)行一鍋法釋放并同時(shí)捕獲、分離、結(jié)構(gòu)表征和的功能分析。使用該方法，將糖綴合物與吡唑啉酮型異雙功能標(biāo)簽-ANPMP 一起孵育以獲得聚糖-2ANPMP 綴合物，然后將其轉(zhuǎn)化為聚糖-AEPMP 綴合物。 該團(tuán)隊(duì)從豬胃粘蛋白、大豆蛋白、人乳低聚糖等制備了一個(gè)標(biāo)記聚糖文庫(kù)，通過 N-乙�；�和全甲基化衍生化后，通過 ESI-MSⁿ 分析對(duì)聚糖進(jìn)行詳細(xì)的結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果揭示了超83個(gè)含有各種天然聚糖表位的高純度聚糖-AEPMP。構(gòu)建鳥槍式微陣列來(lái)研究蛋白質(zhì)和抗血清對(duì)聚糖的結(jié)合情況。
 
    碳水化合物是自然界中最豐富的生物大分子，在許多生物和病理過程中發(fā)揮著重要作用。人們對(duì)聚糖及其在生物醫(yī)學(xué)中的作用日益濃厚的興趣，引領(lǐng)了功能糖組學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。聚糖微陣列已被證明是一種成功的高通量篩選工具，可用于確定蛋白質(zhì)-聚糖相互作用。擴(kuò)展聚糖庫(kù)以包含更多樣化的結(jié)構(gòu)對(duì)于推進(jìn)功能糖組學(xué)至關(guān)重要。 盡管存在用于合成結(jié)構(gòu)確定聚糖的化學(xué)或化學(xué)酶方法，但它們耗時(shí)、昂貴，并且需要大量勞動(dòng)。 這限制了生物醫(yī)學(xué)相關(guān)聚糖的獲取，并阻礙了其確切生物學(xué)作用的確認(rèn)。另一種途徑涉及從天然來(lái)源中釋放、標(biāo)記和分離聚糖。 連接到糖蛋白的N/O-聚糖或連接到鞘糖脂的聚糖可以使用化學(xué)和酶促方法釋放。然而，N-聚糖釋放酶價(jià)格昂貴，并且僅適用于選定的底物。 相比之下，化學(xué)方法，例如肼解和堿解，會(huì)引起嚴(yán)重的脫乙酰和剝離副反應(yīng)，并且需用有毒化學(xué)品。 由于缺乏裂解 O-聚糖的廣譜 O-糖苷酶，它們的釋放依賴于化學(xué)過程，例如通過Carlson 降解進(jìn)行 β-消除或不進(jìn)行醛還原。 然而，由于嚴(yán)重的剝離副反應(yīng)，所得聚糖產(chǎn)物不能在還原端進(jìn)一步衍生化或產(chǎn)率低。 最近發(fā)現(xiàn)家用漂白劑會(huì)釋放糖蛋白中所有類型的 N-聚糖和 O-聚糖，以及鞘糖脂中的聚糖腈。 然而，觀察到了副反應(yīng)，且需要額外標(biāo)記步驟來(lái)進(jìn)一步純化和功能化。 由于聚糖上缺乏天然發(fā)色團(tuán)、還原末端異構(gòu)旋轉(zhuǎn)以及質(zhì)譜 (MS) 靈敏度低，在高效液相色譜 (HPLC) 分離過程中監(jiān)測(cè)聚糖具有挑戰(zhàn)性。 此外，聚糖微陣列的制備通常需要用功能基團(tuán)對(duì)聚糖進(jìn)行衍生化。 因此，在釋放的聚糖上添加適用的熒光標(biāo)簽可以更輕松、更有效地分離和固相固定。 聚糖微陣列的熒光標(biāo)簽可以使用 2-氨基苯甲酰胺、2-氨基苯甲酸、2,6-氨基吡啶和 N-氨基乙基 2-氨基苯甲酰胺 (AEAB) 通過還原胺化來(lái)連接，或通過使用 2- 氨基甲基 N,O-羥乙基 (AMNO)、N-Fmoc-3-（甲氧基氨基）丙胺 (F-MAPA)和 O-芐基羥胺（ BHA）的N-烷基肟縮反應(yīng)連接。 這些標(biāo)簽已用于生成聚糖文庫(kù)，并成功應(yīng)用于篩選聚糖結(jié)合蛋白（GBP）。 還原聚糖通常通過兩步過程用雙功能試劑進(jìn)行化學(xué)衍生化獲得。 最近，報(bào)道了一種新的一鍋法，用于非還原性β-消除釋放和 O-原位標(biāo)記。 使用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮 (PMP) 從糖蛋白中提取聚糖。通過這些方法，兩個(gè)主要步驟，非還原釋放和標(biāo)記，可以同時(shí)進(jìn)行，從而簡(jiǎn)化了聚糖制備的樣品處理。 此外，雙-PMP聚糖衍生物在254 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)烈的紫外線（UV）吸收，并且比其天然形式具有更高的疏水性，這有利于HPLC分離和UV檢測(cè)。 然而，這些方法不會(huì)產(chǎn)生帶有功能基團(tuán)的聚糖來(lái)固定到載玻片上以產(chǎn)生微陣列。
 
該研究團(tuán)隊(duì)提出了一種使用新型吡唑啉酮型異雙功能標(biāo)簽2-(4-(3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-吡唑唑-1-基)苯基)乙腈(ANPMP)的綜合方法 ，能夠?qū)�N/O-聚糖進(jìn)行一鍋法釋放并同時(shí)捕獲、分離、結(jié)構(gòu)表征和功能分析。 該標(biāo)簽被設(shè)計(jì)為包含活性亞甲基和氰基功能基團(tuán)。 在堿性條件下，它可以通過激活活性亞甲基與聚糖綴合，而氰基在聚糖 ANPMP 標(biāo)簽綴合過程中保持穩(wěn)定，但之后可以轉(zhuǎn)化為活性氨基，以便有效固定在活化固相上用于制造聚糖微陣列。使用 ANPMP 在堿性介質(zhì)中開發(fā)了一種高效、通用的先進(jìn)一鍋法釋放和標(biāo)記 N/O-聚糖和游離天然還原聚糖的方法，以驗(yàn)證這些假設(shè)。 隨后，將聚糖-2ANPMP綴合物方便地轉(zhuǎn)化為聚糖-AEPMP（2-（4-（3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-吡唑唑-1-基）苯基）乙胺）綴合物（聚糖-AEPMP） ，含有活性氨基的物質(zhì)，通過HPLC分離，通過ESI-MS與MSⁿ技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并制備成標(biāo)記聚糖文庫(kù)。 此外，高純度聚糖-AEPMP 通過其游離烷基胺共價(jià)固定在 N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 酯活化的載玻片上，以生成鳥槍式天然聚糖微陣列，并進(jìn)行功能研究。
 
   
           方法概述，用于制備糖基-AEPMP共軛物，并生成用于與凝集素和血清樣本進(jìn)行研究的鳥槍式天然聚糖微陣列。
 
 
微陣列制備和檢測(cè)方法，詳述如下。AEPMP 標(biāo)記的聚糖在磷酸鹽緩沖液（100 mM 磷酸鈉，pH 8.5）中重新溶解， 最終濃度為100 μM，并點(diǎn)樣到NHS-酯活化的載玻片上。 使用配備 PDC 80 壓電式噴頭（Scienion GmbH，柏林，德國(guó)）的 sciFLEXARRAYER S3 非接觸式點(diǎn)樣儀將聚糖噴點(diǎn)到載玻片上（每張載玻片上有 16 個(gè)子陣列）。 為每個(gè)聚糖打印四個(gè)重復(fù)點(diǎn)。 所有聚糖微陣列均打印為每張載玻片16 個(gè)子陣列，每個(gè)子陣列 336 個(gè)點(diǎn)。 液滴體積405 pL，并且打印緩沖液作為陰性對(duì)照。 打印后，載玻片在相對(duì)濕度設(shè)定為 65% 的加濕柜中于 25°C 下孵育，使聚糖與載玻片結(jié)合過夜。 然后將打印的載玻片用含有25 mM乙醇胺的100 mM 四硼酸鈉緩沖液（pH = 9.0）在 55 °C 下封閉 2 小時(shí)，使用 MilliQ 水洗滌兩次，干燥，并保存在 -20 °C 直至使用。
 
在微陣列檢測(cè)之前，通過安裝ProPlate 16孔微陣列模塊將每個(gè)子陣列分隔開，并使用100 μL TSMTB緩沖液（20 mM Tris.HCl，150 mM氯化鈉，0.2 mM氯化鈣，0.2 mM氯化鎂，0.05％（v/v）Tween®20，1％（w/v）BSA，pH 7.4）重新水合10分鐘。進(jìn)行分析時(shí)，吸除TSMTB緩沖液，并加入100 μL 含GBPs的PBST緩沖液或含適當(dāng)濃度血清樣本的TSMTB緩沖液。微陣列載玻片用明確定義的生物素化凝集素和血清樣本進(jìn)行探測(cè)。將載玻片密封并在輕柔搖動(dòng)下孵育2小時(shí)，然后用PBST和PBS緩沖液洗滌四次。接下來(lái)，向每個(gè)子陣列添加100 μL熒光標(biāo)記的二抗或Cy3-偶聯(lián)鏈霉素（Cy3-SA），密封并在輕柔搖動(dòng)下孵育1小時(shí)。生物素化凝集素（Vector Labs）除AAL和Con A外，均以10 μg/mL進(jìn)行分析（AAL和Con A以1 μg/mL進(jìn)行分析），結(jié)合的凝集素通過與Cy3-SA（1.0 μg/mL；Solarbio）的二次孵育進(jìn)行確認(rèn)。采用Alexa Fluor 488-偶聯(lián)的兔抗人IgG（5 μg/mL；SouthernBiotech）和Alexa Fluor 488-偶聯(lián)的山羊抗人IgM（5 μg/mL；Abcam）用于檢測(cè)結(jié)合情況。孵育后，載玻片依次用PBST、PBS緩沖液和MilliQ水洗滌四次，然后經(jīng)過簡(jiǎn)短離心干燥以進(jìn)行掃描。使用來(lái)自Innopsys公司（法國(guó)）的InnoScan 710-G微陣列掃描儀對(duì)載玻片進(jìn)行成像。獲得的圖像使用Innopsys公司Mapix 8.5微陣列分析軟件進(jìn)行分析，然后使用Microsoft Excel處理以獲取微陣列結(jié)果。在手動(dòng)對(duì)齊每個(gè)子陣列與綠色通道中微弱可見的聚糖斑點(diǎn)后，進(jìn)行信號(hào)定量。以下方程計(jì)算信號(hào)：平均數(shù)據(jù)=四個(gè)重復(fù)熒光強(qiáng)度均值-背景強(qiáng)度熒光強(qiáng)度均值。從至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算變異系數(shù)。
   
 
 
 
文獻(xiàn)原文鏈接：  https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121617