圖1: 點陣型LFA的靈活布置點的示意圖。

圖1：基于點的LFA的優(yōu)勢：由于風影效應(yīng)，沿著側(cè)向流動方向，每個點（體積>5納升，紅色圓圈）的強度逐漸減小。B 線性和點狀多重試驗的比較（左側(cè)為線性格式，右側(cè)為點狀格式）：沿著側(cè)向流動方向，線和點的強度逐漸減小，在一個通道中依次排列（連續(xù)的點），而一個通道只有一個點則保持恒定的強度。C 使用Epson Perfection V600對B進行定量讀取。灰度強度描述了在ImageJ中分析的8位圖像的像素值，絕對值是根據(jù)峰值下面積（AuP）確定的，與背景有所區(qū)別。

Unisart StructSure®膜的優(yōu)勢
樣品流體的流動動態(tài)對 LFA 的效果起著至關(guān)重要的作用，影響著分析物和抗體在系統(tǒng)內(nèi)的傳輸和相互作用。Unisart StructSure®膜提供了一種特定的流動模式,直接影響LFA的性能。根據(jù)Young-Laplace方程[Olanrewaju等人(2018)]，毛細力與通道寬度呈反比關(guān)系。作為LFA的驅(qū)動力，較窄的通道會增加了樣品的流動性，需要更少的樣品體積來達到相同的流動距離。這在處理有限樣品量時非常有優(yōu)勢，使該測定方法更適用于稀缺樣品的應(yīng)用。此外，更大的驅(qū)動力導(dǎo)致流速增加，使分析物-檢測物-混合物更早到達捕獲抗體。將Unisart StructSure®膜與相同類型的常規(guī)非結(jié)構(gòu)化Unisart膜（CN140）和相同寬度進行直接比較，水和血清通過膜的時間分別縮短了48%和35%，從而改善了粘性溶液的流動性。

此外，如Unisart StructSure®膜所示，將通道寬度從14毫米減小到每個通道寬度為2毫米的6個通道，可以促進層流流動，因為雷諾數(shù)（Re）是預(yù)測流動狀態(tài)的參數(shù)，隨著特征長度（在本例中為通道寬度）的減小而減小，表明雷諾數(shù)較低時出現(xiàn)層流流動。這種流體流動的特點是平滑而有序的流體層平行移動，提供了更可預(yù)測和可重現(xiàn)的流動曲線，這對于設(shè)計精確和可控的實驗至關(guān)重要。層流流動減少了分散，使得檢測成分的相互作用更加局部化和可控化�！綤enis, et al. (2000)】此外，通過樣品與檢測試劑的受控混合，能促進更有效的相互作用，從而增加靈敏度。為了實現(xiàn)這種混合，通過曲線形狀產(chǎn)生湍流，因為樣品的不同部分在曲線內(nèi)的通道外部區(qū)域附近承受的壓力會增加，因此速度變化，導(dǎo)致了分析物的擴散（圖）【Krzyk, et al. (2018)】。流體內(nèi)增強的物質(zhì)聚集使得分析物與檢測器和捕獲抗體接觸，從而改善了結(jié)合。層流流動和湍流的受控產(chǎn)生的結(jié)合導(dǎo)致有益的流體動力學，而過度的分散可能會影響檢測的準確性。

圖2：Unisart StructSure®膜的流體動力學。窄通道在直線段提供層流流動，而在彎曲處由于速度變化而產(chǎn)生湍流。內(nèi)壁上的流速比外壁上的流速減小，導(dǎo)致流體重疊和旋渦。
 

波狀結(jié)構(gòu)的另一個特點是從普通膜的25毫米延伸到Unisart StructSure®膜的26.2毫米的吸收墊距離，為捕獲分子提供更大的距離，從而在分析物和探測器之間提供更長的孵育時間。根據(jù)實驗要求，這種延伸可以提供更靈活的實驗布局。

案例研究- 多重膿毒癥快速診斷試紙
Case study
多重膿毒癥是一種危及生命的疾病，當機體對感染的反應(yīng)失調(diào)時，會導(dǎo)致全身性炎癥和器官功能障礙。及早準確的診斷對于及時干預(yù)和改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前用于多重膿毒癥診斷的最常用生物標志物是降鈣素原（PCT）C反應(yīng)蛋白（CRP），前者通常保持在較低的血液濃度，但在細菌感染（尤其是多重膿毒癥）時會顯著升高，后者則是一般的炎癥標志物。由于CRP是一種敏感的標志物，但對于膿毒癥不具有特異性，而PCT是一種特異性較高但敏感性較低的標志物，二者的結(jié)合可達到平衡，改善多重膿毒癥診斷的敏感性和特異性。此外，PCT確保早期發(fā)現(xiàn)膿毒癥，并區(qū)分細菌性和非細菌性炎癥，從而提供更準確和有針對性的治療決策。測量PCT和CRP的濃度可以提供關(guān)于膿毒癥嚴重程度的信息,有助于急性患者的管理和監(jiān)測。

表1: 用于檢測膿毒癥的生物標志物，以血液濃度作為分界值。
 

借助它們互補的優(yōu)勢，本白皮書提出的方法用于建立一種多重免疫層析法(multiplex LFA)，將PCT和CRP分別以三個濃度作為不同嚴重程度的膿毒癥的分界值(表1)。通過評估斑點的存在/不存在以及相應(yīng)的分界值，可以通過肉眼進行半定量評估，但也可以通過使用sciREADER LF2 (SCIENION GmbH, 圖9)與集成的動力學測量算法進行定量評估。

材料與方法
使用SCIENION的sciFLEXARRAYER SX（圖4）精密微量點樣儀,在Unisart CN 140
StructSure®(賽多利斯, 3UN14ER066S01WS）上打印多重陣列。簡而言之，按照圖 5 所示的檢測布局預(yù)埋10納升三種不同濃度的抗PCT和抗CRP抗體（HyTest）。第二種抗PCT和抗CRP抗體與碳納米顆粒結(jié)合,以夾心測定的形式檢測分析物PCT和CRP。

由于配備了兩個高分辨率攝像頭（圖4，水平攝像頭和垂直攝像頭）,sciFLEXARRAYER系統(tǒng)可以完全控制液滴的生成，從而驗證噴點的質(zhì)量。通過將特定目標靶標成像為參考點，如同Unisart StructSure®膜（圖3）所示，能夠補償目標位置和方向的變化。通過水平攝像頭監(jiān)測液滴的生成、液滴體積、質(zhì)量以及與軸定位的偏差，顯示出納米級的穩(wěn)定液滴（圖 4、5）。在噴點過程結(jié)束時，垂直攝像頭可對目標進行檢測，只有斑點符合特定質(zhì)量標準的膜才能通過檢測。
 

大卡是通過使用一張背板（Kenosha牌）、印刷膜、吸收墊（Whatman CF5，Cytiva品牌）以及樣品應(yīng)用墊（玻璃纖維，Kenosha牌）組裝而成的。之后,使用剪切機（Matrix 2360剪切機，Kinematic Automation公司）將卡片切割成14毫米寬的條形,確保每個膜結(jié)構(gòu)的完整性。將膜條放入由Sartorius和SCIENION GmbH 合作開發(fā)的完美貼合的卡殼中，然后涂上結(jié)合物和樣品的混合物,進行試運行。孵育30分鐘后, 使用帶有集成分析軟件的sciREADER CL2（SCIENION GmbH公司）對條形進行測量和分析。

sciFLEXARRAYER SX（SCIENION）是一種精密微量點樣儀，用于在Unisart CN 140 StructSure®膜上預(yù)埋抗體。箭頭和數(shù)字表示以下內(nèi)容的存在:（i）壓電式點樣毛細管；（ii）用于點樣后對膜成像的垂直相機;（iii）用于可視化和量化滴液參數(shù)的高分辨率水平滴液相機;（iv）膜的靶標支架;（v）96孔板的位置，其中包含待點樣的抗體;（vi）控制sciFLEXARRAYER SX微量點樣儀的軟件的計算機屏幕。

結(jié)果與討論（提出的解決方案）
結(jié)構(gòu)化膜與精密微量點樣儀技術(shù)相結(jié)合可提高性能

可以通過眼睛進行評估
在任何類型的膜上都可以在LFA上進行基于點的多重檢測。由于該檢測的復(fù)雜性，通過眼睛來評估圖案可能具有挑戰(zhàn)性，因此建議使用讀取器進行分析。由于Sartorius Unisart StructSure®膜的結(jié)構(gòu)設(shè)計，可以將視覺點與相應(yīng)的生物標志物相對應(yīng)，簡化評估過程而無需讀取器。在已建立的膿毒癥多重檢測實驗中，即使不是所有的點都出現(xiàn)，也可以很容易區(qū)分膜結(jié)構(gòu)左側(cè)三個通道中CRP的三個點和右側(cè)PCT的點（圖5）,從而確保半定量分析和對感染嚴重程度和類型（細菌性、非細菌性）的決策。小通道可更好地控制檢測區(qū)域內(nèi)不同的捕獲分子的位置。然而,由于點的大小,決定點存在與否仍然是主觀的,因此使用讀取器是有意義的。這種可指定的定位需要高精度的噴點，而 SCIENION的sciDROP PICO 點樣技術(shù)可以實現(xiàn)這一點。非接觸式點樣可確保膜的完整性,從而產(chǎn)生具有可控液滴量的均勻斑點,實現(xiàn)最佳的檢測性能。
 

圖5：Unisart StructSure®膜上的膿毒癥多重檢測：通過在截斷區(qū)域的相應(yīng)斑點的存在/缺失進行半定量評估。1：鼠IgG，檢測對照;2：10 µg/ml CRP的臨界值（低）;3：40 µg/ml CRP的臨界值（中）;4：200 µg/ml CRP的臨界值（高）;5：0.5 ng/ml PCT的臨界值（低）;6：2 ng/ml PCT的臨界值（中）;7：10 ng/ml PCT的臨界值（高）。

信號強度增強
如前所訴,由于反應(yīng)區(qū)域擴大，結(jié)構(gòu)化膜提供了有利的流動動態(tài)，并延長了分析物與抗體之間的孵育時間。與同批次的非結(jié)構(gòu)化Unisart® CN140膜相比，結(jié)構(gòu)化膜的信號強度增加了 52%，這與斑點位置有關(guān)（圖6）。
 

圖6:Unisart StructSure®與非結(jié)構(gòu)化膜的比較。A:非結(jié)構(gòu)膜（左圖）和 Unisart StructSure® 膜（右圖）上 10 納克/毫升 PCT 樣品斑點的半定量評估。藍色矩形內(nèi)的斑點用于B：Unisart StructSure®和非結(jié)構(gòu)化膜上0.5、2、10ng/ml PCT斑點強度的比較。

特定的卡殼裝置提高了檢測的可重復(fù)性并縮短了時間
專為Unisart StructSure®膜條尺寸設(shè)計的樣品盒支持流體動力學特性（圖7A）。通過確保材料之間的均勻過渡，卡殼裝置保證了所有通道中的控制和均勻流動，從而確保更高的重現(xiàn)性。這一點在信號強度尚未完全形成的孵育時間內(nèi)表現(xiàn)得尤為明顯，使用卡殼裝置而非松散的檢測棒孵育30分鐘后，膿毒癥多重LFA的CV值減少了10%（圖7 B）。因此，這種用于日常實驗室或家庭使用的即時檢測可以在較短的時間內(nèi)完成，而無需等待信號完全形成（此處為60分鐘）。
 

圖7：使用LFA盒改善流體動力學。（A）14毫米Unisart StructSure®和常規(guī)Unisart® LFA試劑盒的圖片，由Scienion GmbH和賽多利斯公司合作設(shè)計和制作。（B）與無卡殼情況下，30分鐘和60分鐘孵育后控制點信號變異系數(shù)（CV）的比較。每個變種測試了包括6個控制點的16個試紙條。

同時檢測豐度差異極大的分析物
除了已知的Sartorius Unisart®膜的質(zhì)量外，Unisart StructSure®膜的特性還允許在一根膜條上同時檢測濃度相差4-5個數(shù)量的豐度差異很大的分析物。當將具有大量豐度差異的生物標志物結(jié)合在所需測量范圍內(nèi)時，提高一個生物標志物的靈敏度同時降低另一個生物標志物的靈敏度可能具有挑戰(zhàn)性，因為大多數(shù)檢測成分（如樣品緩沖液、樣品體積、樣品稀釋、固相材料和流體動力學）直接影響兩種檢測方法。通過添加與過量CRP分析物競爭結(jié)合的非標記抗CRP抗體，可以顯著降低CRP實驗的靈敏度，而不會影響PCT檢測所需的靈敏度。通過改變各自的捕獲抗體濃度，可以區(qū)分ng/ml范圍內(nèi)的PCT濃度，同時檢測ng/ml濃度的CRP（圖8）。
 

圖8：調(diào)整捕獲抗體濃度以達到所需的靈敏度

A：在不同的CRP分析物濃度下，根據(jù)CRP捕獲抗體濃度和PCT分析物濃度的變化曲線，在臨界點的低、中、高三個位置進行滴度測定。

B：在不同的捕獲抗體值下，可以區(qū)分CRP和PCT的臨界點。

圖 9：用于LFA檢測定量讀數(shù)的sciREADER LF2

使用Unisart StructSure®膜可以對CRP和PCT臨界值進行半定量評估，但使用SCIENION 的掃描儀技術(shù)可以更容易地區(qū)分臨界值上是否存在斑點。sciREADER LF2是一種便攜式掃描儀設(shè)備，專為 LFA 的動力學和終點分析而設(shè)計，尤其適用于分析由多個檢測器區(qū)域組成的斑點陣列，其強大的網(wǎng)格排列和斑點查找算法確保了分析的準確性。用于檢測高表達血液標志物（如CRP）的夾心免疫測定通常受到鉤狀效應(yīng)的限制。通過實時測量測試點和對照點的信號強度，可觀察到測試與對照比率（T/C）的變化，表明低濃度和極高濃度分析物的信號發(fā)展速度不同，而終點測量時的最終 T/C 值可能相同[Rey等（2017）]。這使得通過動力學測量來擴展LFA的動態(tài)范圍成為可能。

此外,動力學還能在早期階段識別反應(yīng),一旦檢測到臨界值，可以立即停止測量,從而減少測定時間。由于信號強度的發(fā)展速率與夾心式或競爭性測定中的分析物濃度成正比或反比，因此可以使用不同測量點之間的斜率并參照預(yù)先確定的標準曲線進行定量測定，該標準曲線可以在讀取程序中定義為參考。這樣,每次測試時就無需攜帶單獨的標準物質(zhì)即可進行定量測定。

每通道檢測一個結(jié)合物，提高特異性
在全貼試劑盒中，結(jié)合物通常被分散并干燥到適合樣品溶解的墊上。在多重檢測法中，有多種方法可以將檢測抗體整合到一起，例如同時結(jié)合、單獨結(jié)合抗體的混合，同時將所有檢測器固定在釋放墊上，或者將單個結(jié)合物在墊上進行空間分離。無論如何，在運行過程中，樣品-結(jié)合物混合物一起流過膜時，檢測抗體會混合在一起，從而存在交叉污染和非特異性的風險。Unisart StructSure®膜的細分現(xiàn)在提供了全面分離相應(yīng)檢測物的新可能性，避免了非關(guān)鍵反應(yīng)抗體之間的接觸，從而提高了特異性。初步實驗結(jié)果表明，將結(jié)合物直接應(yīng)用到經(jīng)過預(yù)封閉的結(jié)構(gòu)化膜的一個通道中時，可以獲得有希望的結(jié)果，以避免膜與結(jié)合物之間的結(jié)合。此外，分隔的通道可在某些通道中放置疏水性障礙，以實現(xiàn)不同的反應(yīng)時間，以支持相應(yīng)生物標記物-抗體動力學，并滿足檢測不同濃度范圍的生物標記物的要求。目前正在研究結(jié)合物從膜上溶解的能力和相關(guān)的檢測功能，以及通過對膜進行疏水性處理來改進對不同豐度生物標記物的同時檢測。

致謝
作者衷心感謝未來診斷公司作為合作伙伴，在研發(fā)案例研究檢測方面進行發(fā)明、創(chuàng)造和驗證體外診斷產(chǎn)品的合作。