自2019年 12月出現(xiàn) COVID-19 大流行以來，SARS-CoV-2 病毒不斷演變?yōu)槭澜绺鞯爻霈F(xiàn)的許多變種。目前，主要采用兩種方法來識別 SARS-CoV-2 變異株：通過測序?qū)ν暾�病毒基因組進(jìn)行測序，以及定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR。盡管基因組測序非常準(zhǔn)確并可識別任何突變，但常規(guī)基因組測序成本高、耗時(shí)，且需專門設(shè)備與生信解讀。相比之下，基于PCR 技術(shù)，例如定量 PCR 、熔解溫度 RT-PCR 和基于 CRISPR-Cas13a 的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 ，可同時(shí)識別單個(gè)或少數(shù)突變（4 個(gè)，最多 5 個(gè)，因可用熒光通道數(shù)量有限）。因此，迫切需要開發(fā)一種簡單、靈敏、快速的檢測方法，以同時(shí)準(zhǔn)確識別多種變異株。意大利科學(xué)家最近開發(fā)了一種基于微陣列的檢測方法，通過同時(shí)檢測刺突蛋白基因突變來區(qū)分臨床樣本中存在的已知病毒變異株。
SARS-CoV-2 正鏈 RNA 基因組大小約為 30 kb，編碼 29 種蛋白質(zhì)，突變率約為每月兩次非同義突變。在疫苗快速開發(fā)的早期，因首波流行大量患者死亡，新變種免疫逃逸并未被視為優(yōu)先事項(xiàng)。在影響免疫逃逸變異株各因素中，免疫功能低下人群中觀察到的長排毒期,是突變逃逸因素之一。

臨床顯著突變主要發(fā)生在刺突蛋白（S 蛋白，圖1），這是一種介導(dǎo)靶細(xì)胞識別和融合的三聚體包膜糖蛋白。 S蛋白結(jié)構(gòu)任何改變都可能影響病毒感染，并最終決定病毒選擇性優(yōu)勢，影響不同變體感染動力學(xué)。導(dǎo)致全球大多數(shù)感染的五種變異株是 B.1.1.7（ Alpha 變種）、B.1.351（Beta 變種）、B.1.1.28（Gamma 變種 ）、B.1.617.2（Delta 變體）和更大譜系 B.1.1.529（Omicron1、Omicron2 和 Omicron5 變體）。
  圖 1. (a) 刺突蛋白由三個(gè)刺突單體組成，在 SARS-CoV-2 表面形成同源三聚體結(jié)構(gòu)（刺突三聚體）。每個(gè)單體分為兩個(gè)亞基，即 S1 和 S2，在弗林蛋白酶切割位點(diǎn)連接。在病毒融合過程中，S1 亞基中的受體結(jié)合域 (RBD) 與宿主細(xì)胞靶受體 ACE2 結(jié)合，而 S2 則實(shí)現(xiàn)膜融合。 (b) SARS-CoV-2 S蛋白S1亞基的示意圖和氨基酸序列。每個(gè)變體中存在的突變位置，包括 擴(kuò)增子1（S 蛋白編碼序列中的位置 23 至 289 nt）和 擴(kuò)增子2（S 蛋白編碼序列中的位置 1215 至 1545 nt）。 S1：胞外域S1亞基； S2：胞外域S2亞基； NTD：N 末端結(jié)構(gòu)域；RBD：受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；RBM：受體結(jié)合基序； CTD：C 端結(jié)構(gòu)域。
 
 
 
在該研究中，該研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)雙域核酸探針，區(qū)分域用于特異性結(jié)合S蛋白突變序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（表一），編碼結(jié)合域能與芯片表面捕獲探針特異結(jié)合（表二和圖二）。PCR產(chǎn)物標(biāo)有Cy3染料，可被熒光掃描儀檢測。（圖三）。    
圖 2. 實(shí)驗(yàn)示意圖。 (a) 在 L452R 突變的情況下（包含點(diǎn)突變的核苷酸三聯(lián)體以黃色突出顯示，突變以紅色突出顯示），L452R 雙域核酸探針在溶液中與 Cy3 標(biāo)記的單鏈 PCR 雜交，而 L452 Wt 報(bào)告基因則無雜交。 (b) 雙域核酸探針 3' 不同編碼的結(jié)合域（不同顏色代表序列差異）通過與芯片表面相應(yīng)捕獲探針雜交將標(biāo)記的 PCR產(chǎn)品結(jié)合到微陣列芯片不同位置。 (c) 將 Cy3-標(biāo)記的反向引物整合到 PCR 擴(kuò)增子中，通過InnoScan710熒光掃描儀檢測S 蛋白基因突變。該圖顯示L452R 突變的樣品點(diǎn)信號強(qiáng)，非突變 L452 Wt的樣品點(diǎn)無信號。
 
   
圖 3.(a)  雙域核酸探針和Cy3 標(biāo)記的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物示意圖。雙域核酸探針的區(qū)分域小黑 x 表示突變。人 β-肌動蛋白擴(kuò)增子 (Amplicon3) 直接與微陣列表面捕獲探針雜交。 (b) Omicron BA.1、BA.2 和 BA.5 亞變體的特定突變特征。檢測到的突變株顯示在列中，子變株顯示在行中。每個(gè)Omicron 亞變體都可通過特定突變組合模式來識別。 (c) 微陣列點(diǎn)樣方案。 (d) 四個(gè)硅芯片 Cy3 熒光圖像。攜帶 BA.1、BA.2、BA.5 亞變株和無 DNA 模板對照 (NTC) 樣品的 Cy3 標(biāo)記 PCR產(chǎn)物（擴(kuò)增子1、2 和 3）與雙域核酸探針撫育，然后進(jìn)行芯片雜交。圖中黃色方塊用于突出顯示雜交斑點(diǎn)。斑點(diǎn)大小為 400 μm，間距為 800 μm。
 
      這種高特異性多重檢測實(shí)驗(yàn)可對引起全球感染浪潮的病毒變異株進(jìn)行基因分型。該實(shí)驗(yàn)的靈活性允許通過增加捕獲探針和雙域核酸探針來檢測新變異株。
   
 
 
 
文獻(xiàn)原文鏈接：  https://doi.org/10.3390/bios13020269