Chorus助力綠色多肽合成新方向
直到現(xiàn)在，DMF一直被認(rèn)為是固相多肽合成（SPPS）的金標(biāo)準(zhǔn)。但是因為其毒性強(qiáng)，危險系數(shù)高，被列為CMR劑（致癌、致突變或?qū)ι�殖有毒的溶劑）。�?021年11月22日，歐盟在其官方公報上發(fā)布法規(guī)(EU) 2021/2030，增加第76項關(guān)于N,N-二甲基甲酰胺（簡稱DMF或DMFA）的限制條款，正式將DMF納入REACH法規(guī)限制清單。¹  規(guī)定從2023年12月12日起，該物質(zhì)本身及含有該物質(zhì)濃度≥0.3% 的物質(zhì)或混合物不得投放市場。

正是因為這樣，所以亟需找到一種合適的可以替代DMF的方案。世界范圍內(nèi)的多肽相關(guān)研究課題組對多種替代性強(qiáng)、更加環(huán)保的溶劑或混合物進(jìn)行了廣泛研究，并且對其在SPPS中的潛力進(jìn)行了評估。^2-5

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有兩種替代品具有非常好的應(yīng)用前景，分別是N-甲基-2-吡咯烷酮（NBP）和二甲基亞砜（DMSO）與乙酸乙酯（EtOAc）的混合物。^3-5 下面，就讓我們一起來看一下它們在SPPS中的實際應(yīng)用情況吧。

我們在尋找替代DMF的溶液時，通常溶劑的極性和粘度是需要考慮的關(guān)鍵因素。²

DMSO/EtOAc混合物的危險性比較小，并且可以通過改變各組分的比例來調(diào)整溶劑的極性，以獲得最佳的反應(yīng)條件，例如Fmoc去除和偶聯(lián)。不過，使用二元混合物也會帶來一定的挑戰(zhàn)，例如在SPPS過程中，針對不同反應(yīng)需要使用不同的溶劑比例進(jìn)行溶劑輸送。

另一種替代品NBP，這是一種極性鈍化綠色溶劑，在SPPS中具有良好的性能。不過，NBP的粘度較高，難以準(zhǔn)確的輸送氨基酸和試劑。

利用自帶的專利矩陣式液體傳輸技術(shù)（PurePep Pathway）和感應(yīng)加熱功能，PurePep Chorus多肽合成儀可以精確可靠地處理各種溶劑并且自由的調(diào)整合適的溫度。因此，我們利用它研究了三種不同溶劑系統(tǒng)（DMF、NBP和DMSO/EtOAc）在兩種溫度下（室溫和感應(yīng)加熱到50℃）對三種模型多肽的粗產(chǎn)率和純度的影響（表1）。

方法
合成
合成三種不同的多肽，分別是Poly-Ala (H-A10K-NH2)、酰基載體蛋白(65-74, ACP, H-VQAAIDYING-OH) 和促性腺激素釋放激素(pyroGlu1→Gly, G-LHRH, H-GHWSYGLRPG-NH2)^6,7三種肽在常溫和高溫（50℃）條件下，使用不同的偶聯(lián)劑二異丙基碳二亞胺/氰基羥基亞胺乙酸乙酯（DIC/Oxyma）和 O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽/N-甲基嗎啉（HCTU/NMM），以 0. 1 毫摩爾合成規(guī)模在三種不同溶劑（DMF、NBP 和 DMSO/EtOAc）中進(jìn)行合成。
 

以 0.1 mmol 的比例在 Fmoc-Lys(Boc)-Wang樹脂 上合成了 PolyAla，在 Fmoc-Gly-Wang 樹脂上合成了 ACP，在 Rink Amide MBHA 樹脂上合成了 G-LHRH。在 DIC/Oxyma 偶聯(lián)過程中8使用 0.3 M 氨基酸（6 個當(dāng)量）、0.4 M Oxyma（8 個當(dāng)量）和 0.3 M（DIC，6 個當(dāng)量），持續(xù) 2 x 15 分鐘。在 HCTU/NMM 反應(yīng)體系中，使用 0.3 M 氨基酸（6 當(dāng)量）、0.3 M HCTU（6 當(dāng)量）和 0.6 M NMM（12 當(dāng)量）反應(yīng) 2 x 1 分鐘。

Fmoc脫保護(hù)使用20% PIP在室溫或感應(yīng)加熱到50°C下進(jìn)行2 x 2分鐘。無論使用哪種合成溶劑，用TFA:TIS：水（95:2.5:2.5）在室溫下從樹脂中切割肽2小時，然后在冷 Et₂O 中沉淀，離心并傾倒Et₂O。

分析
使用配備 SPD-M20A 檢測器的 Shimadzu LCMS-2020 分析粗肽，色譜柱為 ACE Excel 3 C18-PFP，100 x 3.0 mm。流動相為水（A）和含 0.1% 反式脂肪酸的 MeCN（B）混合物。將 ACP 和 G-LHRH 溶于水/乙腈（1:1）中，在 5 分鐘內(nèi)以 5 70% B 的梯度進(jìn)行分析。PolyAla 肽溶解在純水中，用 0-60%B 的梯度在 9 分鐘內(nèi)進(jìn)行分析，流速均為 1 mL/min。

結(jié)果和討論
我們的研究重點是三種肽，它們在合成方面存在獨特的挑戰(zhàn)。第一種是ACP，一種活性�；�載體蛋白片段，由于在合成過程中容易形成內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)，因此被公認(rèn)為SPPS的評判標(biāo)準(zhǔn)。^6,7 第二種肽是Poly Ala，以其自組裝特性而聞名。最后，我們研究了G-LHRH，這是一種因其與促黃體生成激素釋放激素（LHRH）的關(guān)系而備受關(guān)注的多肽。⁷

這些肽的選擇有利于使用不同的合成溶劑對SPPS中的各種肽的合成過程進(jìn)行全面研究。在改變?nèi)軇┫到y(tǒng)和溫度之后，我們還測試了兩種不同的耦合條件：基于碳二亞胺的金標(biāo)準(zhǔn)耦合系統(tǒng)——DIC/Oxyma與安全高效的試劑—— HCTU/NMM。^8,9

與微波輔助多肽合成不同，Chorus多肽合成儀允許在 SPPS 合成過程中靈活使用各種二元溶劑系統(tǒng)。如表2所示，在DMSO/EtOAc 溶液中，所有三種肽的合成都在恒溫條件下順利進(jìn)行，得到的粗肽純度從68.8%到85.4%不等。在 50°C 進(jìn)行合成時，平均粗純度從77.9% 提高到82.4%。

圖1顯示了在 DMF 和 DMSO/EtOAc 中分別獲得的粗肽紫外色譜圖，證明這兩種溶劑系統(tǒng)之間具有良好的轉(zhuǎn)移性。
 

注：眾所周知，二甲基亞砜（DMSO）會在 SPPS 過程中導(dǎo)致蛋氨酸殘基氧化。然而，我們在氮氣環(huán)境下使用 DMSO/EtOAc 混合物成功合成了淀粉樣β肽，分析方法證實沒有發(fā)生任何蛋氨酸氧化（數(shù)據(jù)未顯示）。

PurePep Chorus多肽合成儀的適用性
溶液校準(zhǔn)
PurePep Chorus 多肽合成儀（圖2）是一種功能強(qiáng)大的固相肽合成（SPPS）設(shè)備，可以輕松處理高粘度溶劑和溶劑混合物。該系統(tǒng)的溶劑校準(zhǔn)選項可確保精確的溶劑輸送，而不論其粘度或成分如何，這對SPPS的成功至關(guān)重要。比較所有三種溶劑中的SPPS，DMSO/EtOAc 在恒溫條件下的粗純度優(yōu)于NBP和DMF。

感應(yīng)加熱
PurePep Chorus 多肽合成儀利用精確的感應(yīng)加熱和振蕩功能，在不過熱的情況下迅速達(dá)到所需的溫度。利用這一特點，可以在50℃溫度下使用DMSO/EtOAc低沸點二元混合物作為溶劑，進(jìn)行高效的固相多肽合成 (SPPS)。提高溫度可使三種溶劑的平均純度更高。