紅外(IR)光譜在酵母和細(xì)菌快速菌株分型方面的應(yīng)用
用于菌株分型和鑒別的光譜檢測解決方案
紅外(IR)光譜展示了其在酵母和細(xì)菌快速菌株分型方面的應(yīng)用前景，該方法有助于改善醫(yī)療保健機構(gòu)積極主動的感染控制策略。
作者
Margie Morgan博士，Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心病理和檢驗醫(yī)學(xué)科臨床微生物學(xué)醫(yī)學(xué)主任
Deisy Contreras博士，Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心病理和檢驗醫(yī)學(xué)科臨床微生物實驗室臨床副主任
Markus Meyer博士，布魯克微生物與感染診斷部門 衛(wèi)生與流行病事業(yè)部主管
引言
微生物耐藥性(AMR)是人類面臨的最大公共衛(wèi)生威脅之一。1AMR不僅每年造成120多萬人死亡，2還帶來巨大的經(jīng)濟損失，并與疾病相關(guān)的發(fā)病率有關(guān)。盡管一些超級細(xì)菌已經(jīng)成為著名的耐藥微生物——比如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和淋病奈瑟菌——但實際問題遠(yuǎn)比這些臭名昭著的案例更為嚴(yán)重，且感染也并不局限于細(xì)菌感染。
耳念珠菌是2009年在日本首次報道的一種酵母菌，3但對韓國血液分離株的回顧性分析表明，最早的已知病例發(fā)生在1996年。4今天，耳念珠菌可以危及生命，并已蔓延到六大洲的30多個國家5。耳念珠菌通常對所有三大類抗真菌藥物(唑類、多烯類和棘白菌素類)都具有耐藥性，并且很容易通過定植患者和受污染的表面和設(shè)備等途徑在醫(yī)院環(huán)境中傳播。
2015年，美國首次報道了耳念珠菌。2020年7月，僅洛杉磯就累計發(fā)生了1000多例病例。6像在美國發(fā)生的耳念珠菌這樣的多重耐藥微生物的爆發(fā)表明，醫(yī)療機構(gòu)需要能夠快速識別微生物菌種的儀器，以便為正確的行動方針提供信息。
分型技術(shù)
傳統(tǒng)的菌株分型技術(shù)，如脈沖場凝膠電泳、多位點序列分型、乳膠凝集和全基因組測序，需要耗費大量的時間和資源，而且不是所有的微生物實驗室都已經(jīng)具備這些技術(shù)。
易于應(yīng)用的分型方法是快速可靠地表征耐藥微生物的核心，而基于傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)的菌株分型技術(shù)正顯示出很好的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的方法相比，F(xiàn)T-IR使用相對簡單，可實現(xiàn)高通量的菌株區(qū)分，每份樣品的分析成本較低。FT-IR測量與紅外光吸收有關(guān)的分子振動，不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的振動頻率不同——例如，脂肪酸和脂質(zhì)中的羧基振動頻率為2800-3000 cm-1，而蛋白質(zhì)中的酰胺基振動頻率為1500-1800 cm-1。FT-IR通過測量整個波數(shù)范圍內(nèi)的吸收光譜來產(chǎn)生樣品的分子指紋。微生物可以通過指紋圖譜的變化進行分類，特別是多糖的吸收區(qū)域，這部分光譜提供了許多分子(如膜糖蛋白)中都存在的多糖結(jié)構(gòu)信息。
明確的菌種鑒定
FT-IR技術(shù)可以與基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，同時用于微生物的鑒定。
基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是一種可靠的技術(shù)，可用于直接對培養(yǎng)皿或患者血液培養(yǎng)物中的微生物進行種屬水平的鑒定。通過主要分析核糖體蛋白，MALDI-TOF MS可以確定微生物獨特的蛋白質(zhì)指紋圖譜，然后將得到的指紋圖譜與參考庫匹配來進行鑒定。強大且高性能的MALDI-TOF MS系統(tǒng)是最新技術(shù)發(fā)展的成果，它可以識別數(shù)千種微生物；有些可以在相同的工作流程中識別AMR的特定標(biāo)志峰或活性。與傳統(tǒng)的鑒定方法相比，7MALDI-TOF MS具有更高的準(zhǔn)確性，獲得結(jié)果的時間更快，成本更低，7因此在許多微生物實驗室中得到了常規(guī)使用。
Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心的微生物鑒定及菌株鑒別
Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心是一個非營利的研究型醫(yī)療機構(gòu)，服務(wù)于洛杉磯及其周邊地區(qū)，該中心采取了綜合措施來應(yīng)對耳念珠菌的挑戰(zhàn)。由于耳念珠菌與其它念珠菌有相似的特征，因此用傳統(tǒng)方法或最新的熒光和生化檢測方法都難以鑒定。因此，Cedars-Sinai的研究人員將注意力轉(zhuǎn)向了能將耳念珠菌區(qū)分出來的創(chuàng)新方法，包括下一代測序法、紅外光譜法和MALDI-TOF質(zhì)譜法。
Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心所做的工作幫助引導(dǎo)了MS和IR兩種方法在加州的臨床應(yīng)用，它是加州首個采購MALDI-TOF 質(zhì)譜的實驗室，通過質(zhì)譜可在菌種水平上明確鑒定耳念珠菌。Cedars-Sinai也是美國首個將全新的FT-IR光譜系統(tǒng)用于更深入的菌株分型的醫(yī)學(xué)中心。起初，他們主要將FT-IR光譜系統(tǒng)用于革蘭氏陰性桿菌(如銅綠假單胞菌)和革蘭氏陽性球菌(如金黃色葡萄球菌)的爆發(fā)分析，之后開始用于耳念珠菌的菌株分型和分類。
2019年，紅外光譜就已成為Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心常規(guī)檢測耳念珠菌的一種成熟方法，但COVID-19的出現(xiàn)給研究帶來了前所未有的障礙，包括對旅行和進入實驗室的限制。到2020年底，大部分資金都被用于抗擊SARS-CoV-2（這是可以理解的），雖然該中心剛剛宣布，多重耐藥耳念珠菌是醫(yī)院和長期護理機構(gòu)的重大威脅。Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心的研究人員決心建立一種檢測耳念珠菌的方法，通過在入院前對高�；颊哌M行檢測來預(yù)防傳播。
耳念珠菌的兩步檢測法
Cedars-Sinai的研究團隊采取逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來鑒定耳念珠菌，以進行有價值的篩查，但為實現(xiàn)更高水平的監(jiān)控，還需要進一步的檢測。今天，Cedars-Sinai的研究人員采用兩步檢測法來診斷耳念珠菌。第一步:使用RT-PCR技術(shù)通過腋窩或腹股溝拭子檢測耳念珠菌；RT-PCR的速度及其無需分離耳念珠菌的優(yōu)點，使研究人員能夠快速識別有風(fēng)險的患者，并對其采取適當(dāng)?shù)母綦x措施。第二步: 培養(yǎng)菌株，并通過紅外光譜進行菌株分型。
該系統(tǒng)可將不同的念珠菌和其它酵母菌區(qū)分開來，可作為指導(dǎo)臨床決策的早期預(yù)警系統(tǒng)。Cedars-Sinai的研究人員已從中看到了希望：最近他們使用了上述兩步系統(tǒng)，在一年的時間里，從700多名高危患者中鑒定出28個耳念珠菌陽性標(biāo)本，相當(dāng)于4%的陽性率。8
該研究所已經(jīng)建立了一個數(shù)據(jù)庫，記錄了Cedars-Sinai收治的每位耳念珠菌陽性的患者。這一寶貴資源將有助于迅速查明未來可能發(fā)生的疫情。
沙門氏菌鑒定
Cedars-Sinai的研究人員還利用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定了自體干細(xì)胞移植患者的干細(xì)胞培養(yǎng)物中的沙門氏菌。9沙門氏菌感染是導(dǎo)致急性腹瀉的主要原因，其臨床表現(xiàn)從腸胃炎到危及生命的發(fā)燒。10發(fā)達國家近年來多次暴發(fā)的主要感染源是食物(通常是雞蛋、肉類、乳制品和蔬菜)和水。2019年，美國爆發(fā)了兩次重大疫情：一次是由家禽接觸引起的，另一次是由新鮮蔬菜引起的。兩次疫情都導(dǎo)致了1000多例病例，前一次疫情蔓延到49個州。11沙門氏菌在醫(yī)院的爆發(fā)會導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病和死亡。
Cedars-Sinai的異常沙門氏菌培養(yǎng)物取自兩名接受外周干細(xì)胞采集術(shù)的患者�；颊呔鶠榕�，年齡為65歲和45歲，分別有多發(fā)性骨髓瘤和再生障礙性貧血病史。兩名患者在兩個不同采集日的培養(yǎng)物均為D群沙門氏菌陽性，但這些培養(yǎng)物表現(xiàn)出不同的聚類和藥物敏感性。后續(xù)的FT-IR分析在兩個患者的樣本中識別出不同亞種的腸道沙門氏菌，解釋了前述現(xiàn)象。12 兩位患者極不可能具有共同的感染源，也顯然沒有嚴(yán)重的沙門氏菌相關(guān)感染。
展望未來
憑借開創(chuàng)性的醫(yī)學(xué)研究成果，定義醫(yī)療保健的教育計劃和廣泛的社區(qū)利益，Cedars-Sinai正為患者護理的質(zhì)量和創(chuàng)新設(shè)立新的標(biāo)準(zhǔn)。繼耳念珠菌和沙門氏菌的分型工作取得成功之后，Cedars-Sinai研究團隊目前正在評估FT-IR識別膿腫分枝桿菌亞種的潛力。該信息可用于預(yù)測細(xì)菌的克拉霉素耐藥性；因此，該技術(shù)應(yīng)用的批準(zhǔn)生效將有助于實現(xiàn)菌株實時分型，縮短獲得克拉霉素最終藥敏結(jié)果所需的時間。
驅(qū)動快速疾病檢測和知情決策的創(chuàng)新儀器，將成為醫(yī)療機構(gòu)有效分析和管理流行病的必要基礎(chǔ)。新興的挑戰(zhàn)要求對現(xiàn)有工具進行評估，以應(yīng)對未來醫(yī)療保健領(lǐng)域的挑戰(zhàn)。
作者簡介
Margie Morgan博士是Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心病理和檢驗醫(yī)學(xué)科臨床微生物學(xué)醫(yī)學(xué)主任。Morgan博士負(fù)責(zé)微生物實驗室的臨床測試，指導(dǎo)55名員工執(zhí)行診斷測試，為住院醫(yī)生和同事提供教學(xué)服務(wù)，并參與微生物學(xué)新診斷技術(shù)的研究。
Deisy Contreras博士是Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心病理和檢驗醫(yī)學(xué)科臨床微生物實驗室臨床副主任。Contreras博士主要研究新診斷技術(shù)及其在臨床實驗室中的應(yīng)用。
Markus Meyer博士是Bruker Daltonics公司(位于德國不來梅) 微生物與感染診斷(MID)部門衛(wèi)生/流行病學(xué)事業(yè)部主管。他2010年加入Bruker Daltonics公司，擔(dān)任各種生命科學(xué)質(zhì)譜儀器的產(chǎn)品經(jīng)理，之后于2018年加入微生物與感染診斷部門，擔(dān)任全球耗材的產(chǎn)品經(jīng)理。
參考文獻
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11Phou S, et al, “Successful autologous hematopoietic stem cell transplants using salmonella positive products collected from asymptomatic donors”, Transfusion, vol 63(4) 861-866, March 7th, 2023.
12 Popa G.L, Papa M.I, “Salmonella spp. Infection – a continuous threat worldwide”, Germs, vol 11(1) 88-96, March 15th, 2021.
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