PTI全自動多肽合成儀在優(yōu)化肽核酸PNA合成中的應用
介紹
肽核酸(PNA)是DNA和/或RNA的合成類似物，因為整個磷酸二酯鍵主鏈被擬肽主鏈取代，核酸堿基通過甲基羰基連接，具有幾種獨特的物理化學性質 (圖1)。[1]
肽核酸(PNA)是DNA和/或RNA的合成類似物，因為整個磷酸二酯鍵主鏈被擬肽主鏈取代，核酸堿基通過甲基羰基連接，具有幾種獨特的物理化學性質 (圖1)。[1]
PNAs能夠通過與互補RNA結合抑制基因表達；在一定條件下，PNAs還可以通過鏈入侵機制與DNA雙鏈序列結合促進基因表達，從而促進D-loop的形成和相應基因的表達。它們的高親和力和特異性使它們不僅可以作為治療藥物，而且可以用于診斷。[3,4]
PNAs的合成通常被認為是一個挑戰(zhàn)，因為它們容易聚集，并且脫保護步驟通常伴隨著副反應。[5]克服第一個問題的策略之一是在耦合步驟中使用大量過量的試劑；然而，合成所需的受N端保護的PNA單體相對昂貴，使得這種方法經(jīng)濟成本偏高。
在本應用筆記中，我們報告了使用全自動多肽合成儀PurePep®Chorus合成PNA的方法優(yōu)化。以PNA1作為參考序列，評估不同的合成條件：偶聯(lián)次數(shù)、PNA單體過量倍數(shù)、反應時間和溫度。得到粗品純度最高的PNA1的最佳條件，然后用于合成其他五個長度和嘌呤(腺嘌呤和鳥嘌呤)含量不同的序列(表1)。后者構成了合成的一個相關因素，因為它們的偶聯(lián)通常由于偶聯(lián)單體的位阻困難而導致低產(chǎn)率。
結果與討論
采用低負荷Rink Amide MBHA樹脂(0.27 mmol.g-1)，采用Fmoc/tBu正交保護方案，采用PurePep®Chorus (Gyros Protein Technologies)以25 μmol的濃度規(guī)模合成PNA1。在室溫下，用20%Pip/DMF進行2 × 5分鐘的樹脂脫保護。偶聯(lián)步驟是在HCTU和NMM存在的情況下進行的，在所有的合成過程中，條件都有很大的不同(表2)。偶聯(lián)步驟之后是一個封端步驟，在室溫下，用10%的Acetic Anhydride/DMF溶液，反應5分鐘。最終脫保護后，用TFA/ TIS/H2O(95:2.5:2.5)溶液在室溫下裂解4小時。
當確定了產(chǎn)生最佳粗純度PNA1的耦合方案，使用相同的策略(方法E)合成其余序列。結果如表3所示。
結論
在本應用筆記中，我們描述了使用全自動多肽合成儀PurePep® Chorus合成PNA的耦合策略的優(yōu)化。我們首先在室溫下使用10倍當量的PNA單體進行1小時的偶聯(lián)反應，該策略產(chǎn)生了非常好的粗品PNA(81%)。我們希望減少單體原料的過量倍數(shù)，同時盡量減少粗品純度的損失，使這種反應在經(jīng)濟上更具可持續(xù)性和“綠色”。最終，我們開發(fā)了一種耦合策略，不僅減少了當量的數(shù)量和反應時間，而且產(chǎn)生了比原始策略更好的粗品PNA。通過在45℃下進行雙耦合，每次2 倍當量，持續(xù)5分鐘，我們能夠將PNA1的粗純度從81%提高到87%。最后，將該耦合策略應用于其他序列的合成。該方案應用于具有不同的長度和嘌呤含量的序列，產(chǎn)生了非常好的粗肽核酸。PurePep® Chorus被證明是這項工作的關鍵工具，因為在PurePep® Chorus全自動多肽合成儀上，從當量、重復次數(shù)、反應溫度、耦合時間等合成程序均可以很容易地調整。
參考文獻
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(Application Note 12; D0029149/B).
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[9] C. Avitabile et al., Tetrahedron Lett 2010, 51, 3716–3718
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