先天性腦積水（Congenital hydrocephalus，CH）也稱(chēng)嬰兒腦積水，是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，每1000名新生兒中就有約1人患有 CH。CH早期對(duì)智力無(wú)影響，晚期可能會(huì)出現(xiàn)表情呆滯、智力遲鈍、視力減退和肢體癱瘓，甚至發(fā)生并發(fā)癥而死亡。CH可通過(guò)神經(jīng)外科 分流進(jìn)行治療，但手術(shù)存在較大風(fēng)險(xiǎn)及并發(fā)癥。因此研究CH的發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的CH預(yù)防、診斷和治療方法顯得至關(guān)重要。

已有研究證明神經(jīng)分化不平衡是CH發(fā)生的主要原因�；�于多種模式生物的遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在胚胎和神經(jīng)干細(xì)胞中大量表達(dá)Trim71， 一種保守的、干細(xì)胞特異的、RNA結(jié)合蛋白（RBP），對(duì)早期胚胎發(fā)生一定的神經(jīng)分化密切相關(guān)。Trim71的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)有多個(gè)CH 作用的突變位點(diǎn)，可以改變Trim71的RNA結(jié)合能力，然而，這種突變?nèi)绾螌?dǎo)致干細(xì)胞分化缺陷和神經(jīng)形成缺陷的分子機(jī)制仍不完全清楚。

 

來(lái)自梅奧診所的Qiuying Liu等人，針對(duì)Trim71中兩個(gè)CH相關(guān)突變——R595H-Trim71和R783H-Trim71進(jìn)行了研究，相關(guān)研究成果以“Different congenital hydrocephalus – associated mutations in Trim71 impair stem cell differentiation via distinct gain-of-function mechanisms”為題，發(fā)表在PLOS Biology上。

因?yàn)門(mén)rim71突變體引起的CH發(fā)病機(jī)制在小鼠和人類(lèi)之間是保守的，因此作者使用小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cells ， mESCs）為模型，來(lái)研究Trim71中CH相關(guān)突變的分子機(jī)制。作者通過(guò)基因敲除和基因編輯技術(shù)，在Trim71中引入R595H或R783H，獲得 四個(gè)突變mESC系，分別代表單等位基因（R595H/+，R783H/+）和雙等位基因突變（R595H，R783H），然后采用蛋白免疫印跡雜交 （Western Blot）、免疫熒光，CLIP-seq, RNA-seq等手段，與野生型mESCs進(jìn)行一系列的比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管跟之前的報(bào)道一樣 ，Trim71中的CH相關(guān)突變R595H和R783H加速了mESCs的分化，增強(qiáng)了神經(jīng)細(xì)胞系的定型，減少了與野生型Trim71靶向mRNA的結(jié)合。然 而每個(gè)Trim71突變體都結(jié)合不同的異位靶mRNAs亞群。R595H-Trim71與編碼β-連環(huán)蛋白的信使核糖核酸結(jié)合，并抑制其翻譯。增加β -連環(huán)蛋白水平可減輕R595H-Trim71 mESCs的分化缺陷，但不能減輕R783H-mESCs中的分化缺陷。這些結(jié)果意味著Trim71的RNA結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的功能發(fā)生突變，通過(guò)不同的病理機(jī)制引起CH，CH患者可以根據(jù)這些不同的機(jī)制進(jìn)行分層，針對(duì)遺傳多樣的CH病因設(shè)計(jì)精確的治療策略。

文中所有的蛋白免疫印跡雜交（Western Blot）操作，均通過(guò)美國(guó)Precision Biosystems公司提供的全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡雜交系統(tǒng)Blotcycler完成。

 

Sox1和Pax6是神經(jīng)外胚層特異性所必需的兩種譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子，與野生型mESCs相比，在兩種Trim71突變體mESCs的定向神經(jīng)分化過(guò)程中表現(xiàn)出更高的表達(dá)（圖1 紅框）

R595H-Trim71 mESCs特異性顯示β-連環(huán)蛋白水平降低，而Ctnnb1 mRNA水平?jīng)]有變化（圖2紅框）。

R595H-Trim71在WT mESCs中的異位表達(dá)降低了β-連環(huán)蛋白水平，而沒(méi)有降低Ctnnb1mRNA水平（圖3紅框）。

 

來(lái)自美國(guó)Precision Biosystems公司的Blotcycler，是一款全自動(dòng)的蛋白質(zhì)印跡雜交系統(tǒng)，Western Blot洗液工作站，可自動(dòng)化完成封閉、孵育、清洗和一抗回收的一系列工作，很好地解放您的雙手。更為重要和有意義的是：專(zhuān)利的流體清洗可以減少二抗在膜上的附著，降低背景，提高信噪比和靈敏度；自動(dòng)化的操作流程避免了手工操作帶來(lái)的誤差，保證了批次內(nèi)和批次間實(shí)驗(yàn)的高度重復(fù)性；高通量操作和多條件的設(shè)定可以輔助您優(yōu)化Western Blot 實(shí)驗(yàn)的條件，例如合適的抗體濃度等，開(kāi)放的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，無(wú)需其他額外投入。Blotcycler是從事Western Blot實(shí)驗(yàn)的科研工作者的最佳選擇。

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