介紹
 
免疫測(cè)定法的開發(fā)非常具有挑戰(zhàn)性，這是因?yàn)楂@得特定信號(hào)需要正確組合樣品和檢測(cè)底物。
 
多年來，Cisbio 開發(fā)了數(shù)百種測(cè)定方法。在本應(yīng)用說明中，我們將展示 MANTIS® 液體處理器及其大容量芯片更換器 (LC3) 配件如何幫助我們?cè)谝韵滤�有關(guān)鍵點(diǎn)上改進(jìn)我們的工藝：可重復(fù)性、時(shí)間、成本和減少操作者肌肉骨骼疾病。在這里，我們將重點(diǎn)介紹兩種類型的均相時(shí)間分辨熒光 (HTRF)®檢測(cè)分析：生物標(biāo)志物和磷蛋白分析。 HTRF 將 TR-FRET（時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移）的熒光靈敏度、時(shí)間分辨率和低背景特性與 FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）的同質(zhì)性結(jié)合在一起。  
背景知識(shí)
 
HTRF 使用兩個(gè)熒光團(tuán)，一個(gè)能量供體和一個(gè)能量受體，它們?cè)诒舜丝拷鼤r(shí)轉(zhuǎn)移能量。這創(chuàng)建了一種同質(zhì)的測(cè)定形式，其中結(jié)合和未結(jié)合的分子不需要分開，因?yàn)閬碜允荏w的熒光發(fā)射僅在分子結(jié)合時(shí)產(chǎn)生。
 
每種測(cè)定都使用夾心形式，其中兩種抗體用HTRF專用熒光團(tuán)標(biāo)記。生物標(biāo)志物檢測(cè)使用兩種對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)具有特異性的抗體（參見圖 2A），而磷蛋白分為兩種測(cè)定方法（參見圖2B）。其中第一個(gè)測(cè)定方法是磷酸化試劑盒，在試劑盒中一種抗體靶向磷酸化位點(diǎn)，而另一種抗體靶向整個(gè)蛋白質(zhì)。
 
     
磷蛋白測(cè)定中的第二個(gè)測(cè)定方法是總測(cè)定試劑盒，它使用兩種抗體靶向目標(biāo)蛋白上的兩個(gè)獨(dú)立表位。為了獲得一對(duì)功能正常的抗體配對(duì)，我們通常篩選 10 種抗體用于生物標(biāo)志物測(cè)定。每種抗體都用熒光團(tuán)、穴狀化合物和d2標(biāo)記。HTRF 供體熒光團(tuán)穴狀化合物由稀土配合物組成，其中嵌入了鑭系離子，如銪或鋱，并產(chǎn)生 1 至 2 毫秒范圍內(nèi)的長壽命發(fā)射，這是時(shí)間分辨檢測(cè)的基本特征。d2 HTRF 受體由于其小尺寸和設(shè)計(jì)，在免疫競(jìng)爭性測(cè)定中具有更高的穩(wěn)定性，并且在某些情況下會(huì)提高測(cè)定靈敏度。
 
對(duì)于磷酸化蛋白分析，我們測(cè)試了五種磷酸化抗體和五種總抗體。
 
為了測(cè)試這些抗體配對(duì)，我們使用重組蛋白作為生物標(biāo)志物，使用細(xì)胞裂解物作為磷酸化蛋白。這些樣品中的每一個(gè)都被稀釋兩次以評(píng)估動(dòng)態(tài)范圍。這些稀釋會(huì)在最終用戶實(shí)施的培養(yǎng)基中進(jìn)行（例如，用于分泌生物標(biāo)志物的培養(yǎng)基，或用于細(xì)胞內(nèi)磷酸蛋白的裂解緩沖液）。由于HTRF使用同質(zhì)形式的一步檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案，因此緩沖區(qū)組成可能對(duì)信號(hào)產(chǎn)生巨大影響。因此，我們開發(fā)了 4 種裂解緩沖液來匹配任何抗體對(duì)去污劑的敏感性。
 
討論
 
在使用MANTIS之前，我們使用 384 孔板，一式三份。所有這些孔板加起來，其中1080 個(gè)孔將留給生物標(biāo)志物試劑盒 ，3360 個(gè)孔留給為磷酸化/總篩選。3 到 9 號(hào)之間的微孔板編號(hào) (見圖3)。
   
此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不可能在一次操作中完成，而且最多需要 3 天才能進(jìn)行一次篩選。因?yàn)槎嗤ǖ酪埔浩鞑贿m合我們的操作，所以我們使用重復(fù)液體分配器完成這些操作，比如Eppendorf的Multipette。2 µL 精確分液的精度太低，板孔之間的交叉污染過多。
 
因此，對(duì)于單塊384 孔板，需要混合三種試劑，每塊板總共有 1152 次移液動(dòng)作。一年后，操作者的肌肉骨骼疾病成為了我們實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)真正需要正視的問題。
 
由于 MANTIS 能夠分配到 1536 孔板形式中，因此我們能夠按比例縮小 1536 孔尺寸的測(cè)定體積。
 
我們能夠?qū)Ⅲw積從 16 µL 樣品和 2 µL 每種抗體減少到 4 µL 樣品和 0.5 µL 每種抗體，而不會(huì)造成任何損失。此外，由于MANTIS 分配 5 µL 比分配 4 µL 更快，我們選擇了它來完成我們的實(shí)驗(yàn)方案。(見 圖 4)  
所以，我們準(zhǔn)備好了。使用 1536 孔板，一次完整的篩選只需要 1 到 3塊微孔板，每塊板只需大約 30 分鐘即可完成分配。這個(gè)時(shí)間還包含了自動(dòng)芯片清洗時(shí)間，在這段時(shí)間內(nèi)用戶可以自由地做其他事情。顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)置的磷蛋白測(cè)定示例和結(jié)果如下所示 (見 圖 5)。
   
總結(jié)
 
在一年多的工作里我們對(duì)這些改進(jìn)進(jìn)行了總結(jié)，這些總結(jié)包含了針對(duì)每種類型的至少十個(gè)項(xiàng)目，我們?cè)谠S多層面上節(jié)省了時(shí)間、金錢和大量的勞動(dòng)。
 
在使用MANTIS 之前，這些項(xiàng)目消耗了 130塊384 孔板。通過改用 1536 孔板，我們成功將消耗的板數(shù)量減少 75%。(見 圖 6A)。這一數(shù)量的板轉(zhuǎn)為總共分配的44400個(gè)板孔。 每個(gè)板孔需要三次分液，總共13.32萬次，這些全部由MANTIS操作完成，而非人工操作(見 圖 6B)。   由于 MANTIS 芯片被設(shè)計(jì)成能夠清潔和使用多達(dá) 100 萬次分液循環(huán)，因此我們不必再擔(dān)心耗材成本 (見圖6C)。以前我們使用非常昂貴的重復(fù)分液器吸頭，但是，當(dāng)使用 MANTIS時(shí)，我們只需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)吸頭來處理在使用時(shí)添加到芯片中的每種試劑。我們還減少了試劑浪費(fèi)，因?yàn)橥ǔＴ嚬苤械乃荔w積可達(dá) 200 µL，但使用MANTIS，其死體積僅有 20 µL。再加上通過將 HTRF 試劑體積除以四來縮小我們的測(cè)定規(guī)模，我們節(jié)省了超過 1500 µg 的標(biāo)記抗體 (見圖 6D)。 
 
還通過在一次操作中進(jìn)行全面篩選，我們估計(jì)節(jié)省了 25 天的手動(dòng)工作量，這樣就不必拆分操作以便由研究人員手動(dòng)執(zhí)行(見圖6E)。手動(dòng)分配需要許多控制和校正步驟，而 MANTIS 提高了可靠性，且將誤差降至最低。
 
總之，MANTIS 正在成為我們實(shí)驗(yàn)室真正的游戲規(guī)則改變者。液體處理器使我們能夠在各個(gè)方面改進(jìn)我們的流程，考慮到一些我們熟知的不可能手動(dòng)執(zhí)行的操作，MANTIS會(huì)幫助到我們開辟新的可能性。