動物活體成像技術(shù)主要包括生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是利用熒光素酶基因標(biāo)記DNA，通過基因表達(dá)產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號（圖1）。熒光發(fā)光采用熒光物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗體、納米材料、藥物等導(dǎo)入到活體體內(nèi)，通過外界激發(fā)光源激發(fā)獲取成像。
 

圖1 生物發(fā)光活體成像檢測原理

 

通過活體成像技術(shù)可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達(dá)和藥物作用效果等生物學(xué)過程。前期小愛介紹了兩種活體發(fā)光成像技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用案例，我們可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求結(jié)合技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)（表1）選擇合適的體內(nèi)發(fā)光技術(shù)。

 

表1 生物發(fā)光與熒光發(fā)光成像技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)

成像設(shè)備	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)	應(yīng)用領(lǐng)域
生物發(fā)光成像	實(shí)時(shí)長期監(jiān)測體內(nèi)的各種生物學(xué)過程； 背景噪聲低，靈敏度高； 無放射性，不損傷體內(nèi)正常細(xì)胞。	成本較高； 波長短穿透力差； 細(xì)胞構(gòu)建耗時(shí)費(fèi)力。	基因表達(dá)，細(xì)胞、病毒和細(xì)菌示蹤等。
熒光成像	簡單、方便、價(jià)廉； 標(biāo)記靶點(diǎn)多樣； 易于被大多數(shù)研究人員接受。	背景噪音強(qiáng)，靈敏度低； 染料可能有毒性。	基因表達(dá)，蛋白和小分子、細(xì)胞、病毒和細(xì)菌示蹤等。

 

本期小愛以生物發(fā)光成像實(shí)驗(yàn)為例帶大家一起學(xué)習(xí)動物活體成像實(shí)驗(yàn)具體操作流程。

 

一個(gè)完整的生物發(fā)光活體成像過程包括構(gòu)建熒光素酶重組質(zhì)粒、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選、熒光素酶活性鑒定陽性克隆，再將陽性克隆細(xì)胞移植到體內(nèi)建立動物模型，進(jìn)而通過小動物活體成像系統(tǒng)檢測動物體內(nèi)特定部位發(fā)出的熒光信號。最后取出腫瘤組織，通過染色進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)分析。

 

1、構(gòu)建熒光素酶重組質(zhì)粒

含熒光素酶的重組質(zhì)粒根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求可以自己實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，也可以來源于其它實(shí)驗(yàn)室惠贈或市售。

 

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選

常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法是化學(xué)轉(zhuǎn)染法，對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等），可以使用轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑聚凝胺(abs42025397)來提高轉(zhuǎn)染效率。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染即可。

 

為篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最低濃度，可以通過建立殺滅曲線來實(shí)現(xiàn)，我們以G-418(abs44062790)最佳篩選濃度的確定為例。

1）第一天：處于對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度（對于需要更高密度來檢測活力的細(xì)胞，可增加接種量）。鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過夜；

2）根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000μg/mL；

3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度G-418的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔；

4） 接下來每3-4天更換新的含G-418的培養(yǎng)基；

5）按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

 

3、熒光素酶活性鑒定陽性克隆

篩選的單一抗性克隆傳代至第五代時(shí)用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性。

1）按1×105個(gè)/孔接種到24孔板，24h后裂解細(xì)胞，12000rpm，4℃離心10min，收集裂解物；
2）取上清10μL加入96孔白板中，向每孔加入50μL熒光素酶底物，反應(yīng)片刻讀取熒光值，每個(gè)克隆設(shè)3個(gè)復(fù)孔；
3）保留熒光值高的細(xì)胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，再過5代后進(jìn)行熒光素酶活性檢測。保留熒光值維持較高的克隆直至第30代，熒光素酶活性最高的幾個(gè)克隆即為陽性克隆。

 

需要注意的是，篩選的陽性克隆細(xì)胞數(shù)理論上應(yīng)與發(fā)光強(qiáng)度具有線性相關(guān)性，并且陽性克隆細(xì)胞應(yīng)和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有相似的生長趨勢。因此，我們在確定陽性克隆細(xì)胞系后可以增加這兩個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)的完整性和可靠性。

 

4、動物模型構(gòu)建

篩選陽性克隆細(xì)胞株后，通常需要將細(xì)胞注射到動物體內(nèi)構(gòu)建模型，通過體內(nèi)成像觀察腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是也需要根據(jù)腫瘤類型和研究目的，選擇最適合的模型。一般腫瘤細(xì)胞的注射方式包括以下幾種：

 

表2 常用腫瘤細(xì)胞注射方式

注射方式	操作	用途
皮下	注射部位包括側(cè)腹面、背側(cè)面及腋下。	為血液及皮膚腫瘤相關(guān)研究提供便利。
腹腔	腫瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔。通常會引起一定程度的腹水及浸潤性轉(zhuǎn)移。	適合某些腫瘤轉(zhuǎn)移過程，如卵巢癌。
尾靜脈	腫瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射，通過肺部的毛細(xì)血管網(wǎng)進(jìn)入動脈血液循環(huán)系統(tǒng)，造成全身多發(fā)轉(zhuǎn)移灶。	常見于血液腫瘤的研究中。
原位	將腫瘤細(xì)胞直接注射至原器官，所營造的腫瘤微環(huán)境更接近于人體。	適用于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤如脊索瘤、腦膠質(zhì)瘤等；前列腺癌、卵巢癌等的轉(zhuǎn)移研究。
脾臟	將腫瘤細(xì)胞注射在脾臟后通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到肝臟。	可以更好地模擬肝轉(zhuǎn)移瘤形成。
左心室	腫瘤細(xì)胞經(jīng)過左心室注射進(jìn)入小鼠體循環(huán)，經(jīng)過一系列過程，最終造成不同器官的轉(zhuǎn)移。	常用于研究骨、腦及乳腺癌轉(zhuǎn)移。

 

小愛以裸鼠皮下移植瘤模型的建立為例，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1）BALB/c nude裸鼠，4周齡，體重（15±2）g，雌雄各3只；
2）取對數(shù)生長期的熒光素酶陽性克隆細(xì)胞，用PBS重懸為55×107/mL 懸液，每只裸鼠左右背側(cè)近腋部皮下接種100μL，共接種6只；
3）接種后第5天采用活體成像系統(tǒng)檢測信號強(qiáng)度。以后每5天觀察一次，連續(xù)觀察30天；
4）觀察前按150mg/kg體重的量腹腔注射底物D-熒光素(abs42017256)，10分鐘后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液，進(jìn)行活體成像觀察皮下腫瘤的生長情況，定量分析各時(shí)間點(diǎn)的熒光值，繪制腫瘤皮下生長曲線。

 

5、病理形態(tài)學(xué)觀察

病理形態(tài)學(xué)觀察常見的染色方式有HE、IF、IHC、mIHC等，染色原理及作用如表3，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的方法進(jìn)行染色分析。值得注意的是，隨著科學(xué)家對疾病的深入探究，越來越多的科研學(xué)者更傾向于mIHC染色技術(shù)，而且發(fā)表的文章影響因子相對較高。

 

動物活體成像觀察結(jié)束后，脫頸處死小鼠，取腫瘤組織，制成石蠟切片，切片厚度為3μm，按照試劑盒說明書的操作步驟經(jīng)染色后觀察組織細(xì)胞的病理形態(tài)。

 

表3 HE、IF、IHC、mIHC染色方法的區(qū)別

染色方法	染色原理	作用
HE：蘇木精—伊紅染色	蘇木精為堿性染液，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。	可顯示組織正常與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)
IF：免疫熒光	抗原與抗體特異性結(jié)合，將熒光素標(biāo)記在抗體或抗原上，然后與其對應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合。	檢測組織中蛋白以及特異性細(xì)胞的表達(dá)分布。
IHC：免疫組化	抗原與抗體特異性結(jié)合，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子和同位素）顯色。	確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對其進(jìn)行定位、定性及相對定量。
mIHC：多重?zé)晒饷庖呓M化	TSA酪酰胺信號放大技術(shù)&抗原與抗體特異性結(jié)合，可標(biāo)記多個(gè)靶點(diǎn)（4~7種顏色）。	對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記，使檢測信號幾何級放大。

 

（注：本文來源于文獻(xiàn)總結(jié)，僅供參考）

 

活體動物光學(xué)成像技術(shù)讓研究人員能夠觀察活體動物體內(nèi)的基因表達(dá)和細(xì)胞活動，是將分子及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)從體外研究發(fā)展到活體動物體內(nèi)的強(qiáng)有力手段，該技術(shù)推進(jìn)了人們對各種生命活動、疾病過程的深入認(rèn)識，正在被越來越廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。