原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）是最常見的慢性膽汁淤積性肝病之一；80%的PSC 患者同時(shí)患有炎癥性腸病(IBD)。PSC常常由于藥物療法收效甚微而發(fā)展為肝硬化，終末期的PSC患者唯一選項(xiàng)只有肝移植。既往的研究認(rèn)為IBD可能會(huì)促進(jìn)PSC的發(fā)生和發(fā)展。

2023年6月6日，德國亞琛工業(yè)大學(xué)附屬醫(yī)院的Christian Trautwein和Kai Markus Schneider相關(guān)團(tuán)隊(duì)在國際知名期刊Nature Communications上正式發(fā)表了題為“Colitis ameliorates cholestatic liver disease via suppression of bile acid synthesis”的研究性文章。研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，PSC和IBD的同時(shí)發(fā)生表明腸肝器官存在互動(dòng)。他們首先發(fā)現(xiàn)PSC小鼠腸道菌群發(fā)生失調(diào)；使用IBD-PSC小鼠模型發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎可以減輕小鼠硬化性膽管炎的肝損傷和纖維化，涉及脂多糖 (LPS) 激活NF-κB、抑制體內(nèi)外膽汁酸（BA）代謝等相關(guān)通路。結(jié)合臨床結(jié)果表明當(dāng)肝臟疾病伴隨額外的腸道炎性疾病時(shí)，會(huì)更有利于膽汁淤積性肝臟疾病的預(yù)后。

1. 急性結(jié)腸炎改善Mdr2−/−小鼠肝細(xì)胞損傷和膽汁淤積

本研究選擇Mdr2敲除動(dòng)物進(jìn)行研究。Mdr2基因，也被稱為Abcb4，該基因編碼一種膜結(jié)合磷脂翻轉(zhuǎn)酶，幫助磷脂進(jìn)入膽汁。Mdr2的缺失會(huì)導(dǎo)致膽管內(nèi)磷脂濃度降低，缺少磷脂的膽汁成分可能會(huì)導(dǎo)致膽管受到損傷，膽石沉淀，誘發(fā)炎癥并進(jìn)一步導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。Mdr2敲除小鼠在出生后2-3周，即可出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷、血管擴(kuò)張及導(dǎo)管增生的表型，8-9周后，小鼠會(huì)出現(xiàn)肝纖維化癥狀，16個(gè)月后，大部分小鼠會(huì)發(fā)生肝癌病變。

本研究利用DSS（葡聚糖硫酸鈉鹽）處理WT和Mdr2−/−小鼠7天后引發(fā)急性結(jié)腸炎，表現(xiàn)為體重減輕、水樣或血性腹瀉、毛發(fā)豎立、運(yùn)動(dòng)和食欲下降以及結(jié)腸縮短；遠(yuǎn)端結(jié)腸觀察到最嚴(yán)重的病變。與對照組相比，DSS組結(jié)腸炎評分顯著升高，具有上皮屏障破壞、中性粒細(xì)胞浸潤和杯狀細(xì)胞丟失，隱窩變形，并伴有帶狀結(jié)構(gòu)等特征。有意思的是，與Mdr2−/−組動(dòng)物相比，Mdr2−/−+DSS組中肝細(xì)胞損傷標(biāo)志物（ALT、AST、GLDH）、膽汁淤積（AP）、caspase3活性顯著降低；相反地，NF-κB 調(diào)節(jié)的抗凋亡A1/Bfl-1和cIAP1明顯上調(diào)。肝臟組織學(xué)表明Mdr2−/−+DSS肝臟中的膽道纖維化、有絲分裂活性和膽管增殖保持不變。這些結(jié)果表明DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎能改善Mdr2−/−小鼠的肝細(xì)胞損傷和膽汁淤積。

圖1. 急性結(jié)腸炎減輕Mdr2−/−小鼠膽汁淤積性肝細(xì)胞損傷

2. 結(jié)腸炎和腸道屏障損傷引發(fā)細(xì)菌成分易位和肝臟炎癥

免疫熒光染色、qPCR和WB證實(shí)DSS顯著降低了腸道緊密連接標(biāo)記物Mucin2 (MUC2)、ZO-1和 Occludin。體內(nèi)FITC-葡聚糖測定發(fā)現(xiàn)，DSS組的FITC-葡聚糖的易位顯著增加；此外，DSS組細(xì)菌 DNA含量增加——腸道屏障損傷致細(xì)菌成分易位增加。組織病理學(xué)檢查顯示Mdr2−/− + DSS 肝臟匯管區(qū)中性粒細(xì)胞增多；與免疫熒光染色一致：肝臟 Ly6G+和CD11b+細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增加。熒光激活細(xì)胞分選（FACS）證明了Mdr2−/− +DSS小鼠肝臟中性粒細(xì)胞積累。Mdr2−/− +DSS小鼠在蛋白水平表現(xiàn)出IL1β、cleaved caspase1和NLRP3高表達(dá)，在mRNA水平表現(xiàn)出Il1β、F4/80、Nos2等基因的過表達(dá)。

圖2. 結(jié)腸炎和腸道屏障損傷引發(fā)細(xì)菌成分易位和肝臟炎癥

3. 結(jié)腸炎抑制Mdr2−/−小鼠膽汁酸的合成和運(yùn)輸

肝臟RNA測序結(jié)果顯示， Mdr2−/−組與Mdr2−/− +DSS組間有近400個(gè)顯著差異的基因。基因集富集分析（GSEA）顯示Mdr2−/−+DSS組的細(xì)胞色素P450抑制膽汁分泌、膽固醇代謝、藥物或異生物質(zhì)代謝途徑；實(shí)時(shí)PCR證實(shí)了肝臟Cyp7a1和Cyp27a1在Mdr2−/−+DSS組顯著減少；Cyp7A1蛋白表達(dá)強(qiáng)烈減少。質(zhì)譜成像（MALDI-MSI）顯示，肝臟�；悄懰幔═CA）在Mdr2−/−顯著增加， DSS處理后明顯減少；而WT小鼠沒有顯著改變。上述結(jié)果通過HPLC-MS/MS測量血清中膽汁酸進(jìn)行確證，小鼠靜脈血、門靜脈血、肝臟和盲腸糞便中的總膽汁酸顯著降低，膽汁酸中間體7α-羥基-4-膽汁烯-3-酮（C4）的濃度也顯著降低。這些結(jié)果表明，DSS 引發(fā)的急性結(jié)腸炎導(dǎo)致BA合成、攝取和分泌的肝臟轉(zhuǎn)錄程序受到顯著抑制，從而引發(fā)全身BA水平降低。

圖3. 結(jié)腸炎抑制Mdr2−/−小鼠的膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)

4. DSS觸發(fā)肝臟炎癥介導(dǎo)BA代謝

與炎癥途徑相關(guān)的基因、基因集（上皮細(xì)胞的細(xì)菌侵襲、Toll樣受體信號傳導(dǎo)、趨化因子信號傳導(dǎo)等途徑）在Mdr2−/−+DSS肝臟中顯著上調(diào)。脾臟與體重比增加，表明Mdr2−/−+DSS組動(dòng)物全身免疫激活和腸道毒素易位。Spearman相關(guān)性揭示了炎癥基因（Tnf、Il1β、Nlrp3、Tlrs）與BA代謝相關(guān)基因（Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1、Cyp7b1、Fxr2、Ntcp、Oatp2、Bsep、Mrp2）之間存在負(fù)相關(guān)。并在已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中觀察到的類似情況，LPS 刺激導(dǎo)致體外系統(tǒng)中膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)和合成基因劇烈下調(diào)。

LPS注射同樣表現(xiàn)出結(jié)腸炎樣癥狀。Mdr2-/-+LPS 小鼠表現(xiàn)出膽汁淤積性肝細(xì)胞損傷的緩解，伴隨血清 AST、ALT 和AP水平顯著降低；免疫組化表明 caspase 3主要在小鼠匯管區(qū)的免疫細(xì)胞中表達(dá)；抗凋亡A1/Bfl-1和cIAP1蛋白表達(dá)上調(diào)；共染色顯示TUNEL陽性肝細(xì)胞較少。這些結(jié)果表明LPS注射會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞明顯凋亡，但不會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。Mdr2-/-+LPS的肝臟中浸潤性中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，磷酸化NF-κB P65的蛋白表達(dá)增加和肝細(xì)胞核易位，證明NF-κB激活以及炎癥基因（Nfκb、Tnfα、Il1β等）。與之前的DSS模型一致，關(guān)鍵基因Cyp7A1、Cyp8B1和Cyp27A1的mRNA水平、膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ntcp、Oatp2、Bsep、Mrp2和Mrp3）也顯著減少。上述結(jié)果表明膽汁酸穩(wěn)態(tài)獨(dú)立于回腸或肝臟FXR信號傳導(dǎo)的反饋抑制，由DSS誘導(dǎo)的肝臟炎癥引起。

圖 4. DSS通過觸發(fā)肝臟炎癥介導(dǎo)BA代謝

5. NF-κB 信號傳導(dǎo)缺失加劇Mdr2−/−小鼠的膽汁淤積

相關(guān)性分析顯示NF-κB和BA代謝基因顯著負(fù)相關(guān)。使用Mdr2−/−NemoΔhepa小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該小鼠生殖力低，年輕時(shí)有嚴(yán)重黃疸、體重減輕，甚至自發(fā)死亡，阻止了進(jìn)一步誘導(dǎo)結(jié)腸炎。即使在穩(wěn)態(tài)下，NF-κB 缺乏也會(huì)加劇膽汁淤積性肝損傷。流式細(xì)胞術(shù)顯示Mdr2−/−NemoΔhepa肝臟中嗜中性粒細(xì)胞積累；H&E、CK19 和天狼星紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣泛的膽管增殖和纖維化惡化。Mdr2−/−NemoΔhepa小鼠中Cyp7A1蛋白顯著上調(diào)，NEMO缺失導(dǎo)致肝臟總BA、血清中未結(jié)合BA的水平增加。這些發(fā)現(xiàn)表明肝細(xì)胞 NF-κB限制了Mdr2−/−小鼠的膽汁淤積，并作為結(jié)腸炎產(chǎn)生保護(hù)作用的中間介質(zhì)。

圖5. NF-κB信號傳導(dǎo)缺失加劇Mdr2−/−小鼠的膽汁淤積

6. 慢性結(jié)腸炎減輕Mdr2−/−小鼠肝病進(jìn)展

長期低劑量的DSS喂養(yǎng)，導(dǎo)致Mdr2−/−小鼠表現(xiàn)出結(jié)腸炎癥狀，伴有腹瀉、結(jié)腸發(fā)炎、結(jié)腸長度縮短以及較高的脾臟與體重比；血清生化參數(shù)（ALT、AST、AP和GLDH）、caspase3顯著降低，抗凋亡蛋白（A1/Bfl-1和cIAP1）上調(diào)。小鼠膽管間隔纖維化得到改善，并通過天狼星紅和膠原蛋白I染色的定量證明。與之一致的是，Mdr2−/−+DSS小鼠中纖維化標(biāo)記物（ Col1a1、Col1a2、Col3a1）和活化的HSC標(biāo)記物（Timp1）的表達(dá)顯著降低。此外，肝臟炎癥基因（Icam-1、F4/80、Tlr4、Il1β、Nlrp3、Nfkb、Ccl5、Ifng、Il12a、Il10 ）的表達(dá)顯著增加，伴隨著磷酸化 NF-κB P65 蛋白水平升高和肝細(xì)胞核易位。與膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因（Cyp7a1、Cyp27a1）的mRNA水平、Oatp2、Mrp2）劇烈減少，肝臟 FXR 信號傳導(dǎo)（Fxr、Shp）不受影響。這些研究結(jié)果表明，慢性結(jié)腸炎引發(fā)的肝臟炎癥通過抑制膽汁酸合成來減少膽汁淤積性肝損傷和膽間隔纖維化。

圖6. 慢性結(jié)腸炎可減輕Mdr2−/−小鼠的肝臟疾病進(jìn)程

7. 臨床腸道炎癥與PSC患者較長的無肝移植生存期相關(guān)

研究團(tuán)隊(duì)納入70例臨床患者，發(fā)現(xiàn)任何節(jié)段腸道（回腸末端、升結(jié)腸、降結(jié)腸或乙狀結(jié)腸）組織學(xué)炎癥的存在與肝移植或死亡風(fēng)險(xiǎn)降低存在相關(guān)。Kaplan-Meier分析表明組織學(xué)炎癥的嚴(yán)重程度（分級為無炎癥、輕度炎癥、中度和重度炎癥）與生存估計(jì)相關(guān)，無炎癥組的預(yù)后結(jié)果更差。

圖7. 腸道組織學(xué)炎癥可改善PSC患者的無肝移植生存期

8. 小結(jié)

一直以來結(jié)腸炎和屏障功能障礙被證明不利于肝臟和其他器官系統(tǒng)的多種疾病。然而，本研究的IBD-PSC小鼠模型揭示了結(jié)腸炎對Mdr2−/−小鼠肝損傷的保護(hù)作用。綜合運(yùn)用了多種組學(xué)技術(shù)（轉(zhuǎn)錄組、靶向/空間代謝組、16S rDNA微生物多樣性）和傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎引發(fā)細(xì)菌成分易位和肝臟炎癥，導(dǎo)致膽汁酸合成和運(yùn)輸受阻；深入研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號傳導(dǎo)缺失加劇膽汁淤積。而慢性結(jié)腸炎引發(fā)的肝臟炎癥可以通過抑制膽汁酸合成來減少膽汁淤積性肝損傷和膽間隔纖維化；并通過臨床案例證實(shí)實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果。本研究表明的腸道屏障炎癥損傷具有肝臟保護(hù)作用，為長期存在的IBD-PSC關(guān)聯(lián)提供了新的視角，并為PSC多器官治療策略的臨床研究提供了強(qiáng)有力的實(shí)證依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

Colitis ameliorates cholestatic liver disease via suppression of bile acid synthesis. Nature Communications. 2023.

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本研究通過多組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控膽汁酸可改善膽汁淤積性肝病。膽汁酸作為一類具有特殊生理作用的小分子，近年來被證實(shí)在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在本研究中，利用膽汁酸分析發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎抑制了膽汁酸中間體C4的產(chǎn)量，是膽汁酸的合成和運(yùn)輸受阻的重要信號。在確認(rèn)回腸或肝臟FXR信號傳導(dǎo)沒有顯著差異后，本研究以炎癥為切入點(diǎn)深入挖掘其相關(guān)機(jī)制。針對膽汁酸譜，麥特繪譜擁有兩套絕對定量檢測方案：膽汁酸基礎(chǔ)版和膽汁酸旗艦版，支持膽汁酸與菌群聯(lián)合分析。

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