腹瀉疾病除在兒童和幼小動物上有著極高的死亡率外，還造成機體腸道屏障功能受損繼而引發(fā)腸道炎癥，最終導致生長遲緩。腸道菌群與腹瀉疾病密切相關(guān)，一些特定的細菌菌株已被證明具有抗腹瀉作用，然而其抗腹瀉機制尚未闡明。

2023年6月6日，華中農(nóng)業(yè)大學陶詩煜副研究員團隊在npj Biofilms and Microbiomes（IF=9.2）發(fā)表題為“Limosilactobacillus mucosae-derived extracellular vesicles modulates macrophage phenotype and orchestrates gut homeostasis in a diarrheal piglet model”的研究論文。該團隊以新生仔豬、無菌(GF)小鼠和無特定病原體(SPF)小鼠為動物模型，結(jié)合多組學、糞便微生物移植(FMT)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 (ETEC K88)誘導的腸道炎癥損傷模型以及黏膜乳桿菌(L. mucosae)及其衍生的胞外囊泡(EVs)的干預技術(shù)，系統(tǒng)地研究了新生腹瀉仔豬腸道菌群特征，揭示了腸道菌群與腹瀉疾病之間的關(guān)系，闡明了健康仔豬糞便來源的乳桿菌抗腹瀉的潛在機制。（麥特繪譜提供Q300全定量代謝組檢測分析服務）

本研究實驗設計

圖1. 本研究試驗設計

研究結(jié)果

1. 健康仔豬和腹瀉仔豬腸道菌群存在差異

本研究首先收集了新生健康仔豬和腹瀉仔豬的糞便樣品各30例進行宏基因組測序。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)腹瀉和健康仔豬的微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)之間存在著巨大的差異，腹瀉仔豬腸道微生物的物種多樣性升高但豐富度降低。兩組仔豬的腸道微生物在種水平上存在巨大差異，其中有四個乳桿菌種顯著富集于健康仔豬組。隨機森林分析表明，羅伊式乳桿菌(L. reuteri)和黏膜乳桿菌(L. mucosae)是區(qū)分健康仔豬和腹瀉仔豬的關(guān)鍵菌種，提示它們可能在對抗腹瀉疾病中起著重要的介導作用。KEGG功能分析顯示，新生腹瀉仔豬的LPS生物合成通路顯著高于健康仔豬且糞便中的LPS含量也明顯高于健康仔豬。

圖2. 新生腹瀉仔豬與健康仔豬種水平腸道菌群特征

2. 腹瀉仔豬糞便菌群移植導致GF小鼠生長遲緩、全身炎癥和腸道炎癥損傷

本研究將新生仔豬的糞便微生物群移植到GF小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植腹瀉仔豬糞便微生物群的GF小鼠生長發(fā)育遲緩，并伴有嚴重的全身炎癥反應。與供體結(jié)果一致，健康仔豬和腹瀉仔豬微生物受體GF小鼠之間的腸道微生物群區(qū)系結(jié)構(gòu)也存在明顯差異。值得注意的是，一些腸道微生物群相關(guān)的功能途徑從供體豬轉(zhuǎn)移到受體小鼠身上，如LPS的生物合成。另外腹瀉仔豬微生物受體小鼠血清中的LPS濃度顯著高于健康仔豬微生物受體小鼠的濃度。代謝組學結(jié)果顯示，兩組受體小鼠的糞便代謝物存在顯著差異。一些具有抗炎作用的代謝物(3,4-二羥基苯丙酸、高香草酸和苯乳酸在健康仔豬微生物受體小鼠中富集，而促炎代謝物(吡啶甲酸)則在腹瀉仔豬微生物受體小鼠中富集。

圖3. H-FMT GF小鼠與D-FMT GF小鼠的生長、全身炎癥和腸道轉(zhuǎn)錄組特征的評估

另外，腹瀉仔豬腸道微生物群移植后對受體GF小鼠腸道發(fā)育也有巨大影響，具體表現(xiàn)為各腸段組織的基因表達譜發(fā)生顯著變化。RNA-seq結(jié)果顯示，5個腸段的差異基因主要富集在與炎癥和免疫相關(guān)的信號通路上，如NF-κB和PI3K-AKT。NFκB和AKT是介導炎癥反應的重要蛋白分子，磷酸化后激活其生物學功能。WB結(jié)果顯示，NF-κB和AKT的磷酸化在腹瀉受體小鼠的腸道中均升高，而緊密連接蛋白表達水平降低。同時促炎細胞因子水平在腹瀉仔豬微生物受體小鼠腸道組織中也同樣升高。以上結(jié)果表明，腹瀉個體腸道菌群紊亂通過激活炎癥信號通路，損害腸道屏障功能，引發(fā)機體腸道炎癥反應。

圖4. H-FMT GF小鼠與D-FMT GF小鼠的腸道屏障、炎癥反應和微環(huán)境特征

3. L. mucosae通過抑制炎癥反應和調(diào)節(jié)腸道菌群緩解GF受體小鼠腹瀉癥狀

上述宏基因組結(jié)果提示L. reuteri和L. mucosae是區(qū)分健康和腹瀉新生仔豬的關(guān)鍵菌種。為了驗證它們是否具有潛在的抗腹瀉功效，研究團隊從健康新生仔豬糞便樣本中分離出L. reuteri和L. mucosae菌株后進行后續(xù)干預實驗。結(jié)果顯示，只有L. mucosae能夠顯著緩解由腹瀉仔豬糞便微生物群所致的GF小鼠生長遲緩和腸道炎癥損傷。16S rRNA基因測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)L. mucosae干預后腹瀉仔豬微生物受體小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，乳酸菌屬在L. mucosae干預組顯著富集。

圖5. L. reuteri和L. mucosae對腹瀉仔豬糞便菌群所致腸道損傷的緩解作用

4. L. mucosae通過抑制炎癥反應和調(diào)節(jié)腸道菌群緩解ETEC K88攻毒小鼠腹瀉癥狀

本研究還探討了L. mucosae對ETEC K88攻毒SPF小鼠后的影響。數(shù)據(jù)顯示L. mucosae通過抑制LPS的合成、NF-κB和AKT的磷酸化表達及增加乳酸菌豐度，有效緩解由ETEC K88攻毒引起的炎癥反應和腸道損傷。

圖6. L. mucosae對ETEC K88攻毒小鼠腸道損傷的緩解作用

5. L. mucosae衍生的EVs (LmEVs)介導巨噬細胞分型緩解ETEC K88攻毒小鼠腹瀉癥狀

微生物對宿主生理功能的調(diào)節(jié)除了與宿主直接相互作用外，還可以通過分泌活性物質(zhì)來介導。細菌分泌的胞外囊泡可以通過運輸和遞送調(diào)節(jié)宿主信號通路和細胞過程的效應分子來影響宿主的健康。本研究成功分離并鑒定了LmEVs進行后續(xù)的干預試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LmEVs能夠緩解腹瀉癥狀且比親本細菌更佳。

圖7. LmEVs對ETEC K88攻毒小鼠腸道損傷的緩解作用

6. 巨噬細胞是LmEVs緩解ETEC K88攻毒小鼠腹瀉癥狀所必需的

巨噬細胞作為啟動和調(diào)節(jié)炎癥反應的核心細胞，可以產(chǎn)生多種細胞因子，促進腸道上皮細胞增殖，調(diào)節(jié)上皮屏障的完整性，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，LmEVs干預能激活M2巨噬細胞極化，抑制炎癥調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB和AKT)的表達。然而，在巨噬細胞消除小鼠模型中，LmEVs喪失了緩解腹瀉癥狀的能力。以上結(jié)果表明，LmEVs通過調(diào)節(jié)巨噬細胞表型緩解腹瀉癥狀。

圖8. 巨噬細胞清除對LmEVs在緩解ETEC k88攻毒小鼠腸道損傷中的影響

小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬中腸道菌群紊亂，主要特征是乳酸菌豐度降低、大腸桿菌豐度增加和LPS生物合成通路增加，其中L. mucosae和L. reuteri是區(qū)分仔豬健康和腹瀉的關(guān)鍵細菌；腹瀉仔豬微生物群移植GF小鼠后導致其生長遲緩、腸道炎癥損傷、腸道菌群及代謝紊亂；機制上，腹瀉個體的腸道菌群通過激活LPS促炎信號通路，導致腸道屏障功能受損，過量的LPS從腸腔轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)中，誘發(fā)全身性的炎癥反應，最終導致生長遲緩；從健康仔豬糞便中分離的L. mucosae可緩解小鼠腹瀉癥狀；L. mucosae衍生的EVs調(diào)節(jié)巨噬細胞表型緩解ETEC K88攻毒小鼠的腹瀉癥狀。

圖9. 本研究結(jié)果總結(jié)圖

原文文獻

Li, J., Feng, S., Wang, Z. et al. Limosilactobacillus mucosae-derived extracellular vesicles modulates macrophage phenotype and orchestrates gut homeostasis in a diarrheal piglet model. npj Biofilms Microbiomes 9, 33 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

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供稿：陶詩煜副研究員團隊

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