FISH熒光原位雜交技術(shù)與熒光顯微鏡

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）是臨床病理檢測中廣泛運(yùn)用的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)診斷技術(shù)，其原理是用熒光染料直接或間接標(biāo)記的DNA核酸探針與待測樣本中的DNA核酸序列按照堿基互補(bǔ)配對的原則進(jìn)行雜交，然后通過熒光顯微鏡觀察熒光信號位置、數(shù)量等來判斷待測序列的缺失、擴(kuò)增及易位等情況。
 

FISH熒光原位雜交原理（來源NIH）
 

目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)、基因組進(jìn)化研究、病毒感染分析等眾多領(lǐng)域。在臨床中應(yīng)用較多的有以下幾種：

（1）乳腺癌Her-2/neu基因檢測，乳腺癌細(xì)胞中Her-2/neu基因的擴(kuò)增一般預(yù)示著患者預(yù)后較差，應(yīng)用針對該基因異常擴(kuò)增的靶向治療藥物，能特異性地控制癌細(xì)胞的生長，改善病人預(yù)后。Her-2/neu擴(kuò)增是靶向藥物使用的關(guān)鍵指標(biāo)，而檢測Her-2/neu擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)即為FISH
 

MC50-S拍攝的兩種Her-2檢測結(jié)果（紅多于綠表示擴(kuò)增，要用藥）

（2）宮頸癌TERC基因檢測，準(zhǔn)確區(qū)分宮頸細(xì)胞高度癌前病變與低度癌前發(fā)育異常，靈敏度和特異性超過百分之90；

（3）膀胱癌3、9、7、17號染色體數(shù)目異常檢測，使用樣本為尿液，屬于無創(chuàng)性早期診斷；

（4）產(chǎn)前檢測，13、18、21、X、Y染色體數(shù)目異常檢測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常胎兒并判斷染色體疾病種類；

（5）血液腫瘤檢測，通過FISH檢測特定基因，可準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)后及指導(dǎo)臨床個(gè)性化治療。

FISH技術(shù)本質(zhì)是對遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測，所使用的標(biāo)本類型可以包括1、遺傳�。和庵苎�、羊水、絨毛、胎兒臍帶血，或羊水和絨毛的間期細(xì)胞；2、血液�。和庵苎�或骨髓的染色體或間期細(xì)胞；3、實(shí)體腫瘤（包括骨髓活檢）。理論上講，任何含有足夠癌細(xì)胞或DNA的組織、細(xì)胞或體液（如胸水、腹水等）標(biāo)本都可進(jìn)行相應(yīng)的基因狀態(tài)檢測。

 

總體而言，F(xiàn)ISH可以檢測100kb左右的異常，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于明場下核型分析的分辨率，同時(shí)由于是原位雜交，可以直接體現(xiàn)異常細(xì)胞百分比，對于臨床后期治療有著很強(qiáng)的指導(dǎo)作用，且耗時(shí)短，操作簡單，已逐步成為臨床檢測、預(yù)后監(jiān)測、用藥指導(dǎo)等不可或缺的技術(shù)手段。

 

FISH熒光原位雜交的成像挑戰(zhàn)

（1）熒光信號點(diǎn)弱，需要大功率熒光光源激發(fā)。由于不適當(dāng)?shù)陌�埋、固定或探針本身等因素，需要使用高亮度光源才能對熒光探針進(jìn)行激發(fā)。傳統(tǒng)使用汞燈作為熒光光源，在亮度等方面具有一定的優(yōu)勢，但同時(shí)存在熱損傷、壽命短、需要預(yù)熱等待、維護(hù)復(fù)雜等問題，目前已逐步被大功率LED光源所取代。明美系列大功率LED熒光光源克服汞燈的缺點(diǎn)，光譜覆蓋大部分探針激發(fā)波段，同時(shí)具有亮度高、低光毒性、低熱損傷、過萬小時(shí)壽命、即開即用等特點(diǎn)，是FISH檢測中理想的熒光光源。
 

 

（2）容易有背景噪聲干擾，需要高截止性能的濾光片組。在使用高亮度熒光光源情況下，使用長通濾光片或截止性能差（OD截止深度低）的濾光片，會導(dǎo)致背景噪聲比正常情況高，而所需要的探針信號會被淹沒在噪聲中，從而造成假陽性或假陰性結(jié)果。明美熒光激發(fā)塊" a="">明美熒光激發(fā)塊">明美熒光激發(fā)塊和研究級熒光顯微鏡使用進(jìn)口濾光片，根據(jù)需要可選擇不同窄帶濾光片或雙通濾光片，可有效消除背景熒光干擾，獲得高信噪比的熒光成像。
 

進(jìn)口CHROMA濾光片，具有高透光率和優(yōu)良的截止性能
 

（3）不同通道下探針信號疊加的挑戰(zhàn)，包括熒光顯微鏡本身性能及FISH圖像處理軟件功能。

對于熒光顯微鏡需要①具有多熒光通道，例如常規(guī)的FISH檢測需要使用DAPI、FITC、TexasRed分別對細(xì)胞質(zhì)、蛋白質(zhì)（抗體）、細(xì)胞骨架進(jìn)行標(biāo)記，就要求熒光模塊至少具有三個(gè)通道；②機(jī)身穩(wěn)定及調(diào)焦機(jī)構(gòu)的精細(xì)程度，F(xiàn)ISH檢測通常在100倍物鏡下進(jìn)行，信號點(diǎn)可能在不同的焦面，就需要多次微調(diào)焦面以得到全部的信號點(diǎn)，高倍下的操作要求顯微鏡具有良好的剛性及精細(xì)的調(diào)焦行程，以避免圖像漂移和遺漏信號點(diǎn)。

常用的探針熒光染料
 

 

對于軟件需要①能對信號點(diǎn)進(jìn)行增強(qiáng)及將背景熒光消除，部分探針信號點(diǎn)亮度較弱，需要通過軟件對其進(jìn)行增強(qiáng)，以避免被背景熒光覆蓋；②單通道下的圖像疊加，信號點(diǎn)可能位于不同焦面，需獲得多張圖像進(jìn)行疊加合成以得到該通道下目標(biāo)區(qū)域全部的信號點(diǎn)；③多通道的圖像疊加，得到的FISH結(jié)果是需要對不同探針的位置、數(shù)量等情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，需要軟件將不同通道下得到的圖像疊加在一起，需要保證疊加時(shí)不漂移，避免信號點(diǎn)錯(cuò)位、重疊等造成結(jié)果失真。

 

明美研究級熒光顯微鏡配備6孔落射熒光模塊，可按需配置6個(gè)激發(fā)通道，采用進(jìn)口主機(jī)，機(jī)身穩(wěn)定剛性高，針對FISH圖像處理，明美開發(fā)了專業(yè)的處理軟件，具有信號增強(qiáng)、背景去除、通道疊加、出具報(bào)告等強(qiáng)大功能。
 

疊加合成圖片
 

（4）熒光成像要求相機(jī)靈敏度高。FISH探針信號往往都是點(diǎn)狀或成簇分布，要求顯微成像相機(jī)有較高的靈敏度，同時(shí)具有良好的噪聲控制，這樣才能在背景熒光中獲得所需的點(diǎn)狀/簇狀探針信號。明美MC50-S等熒光顯微相機(jī)，像元尺寸超過3μm*3μm，具有優(yōu)良的弱熒光捕獲能力，同時(shí)具有超低的讀取噪聲，可保證FISH檢測中獲得良好的熒光成像。

（5）FISH高倍檢測下對物鏡成像性能的要求。FISH檢測對象是遺傳物質(zhì)上的信號點(diǎn)，通常使用40-100倍物鏡進(jìn)行成像，需要能分辨出點(diǎn)狀或簇狀的探針信號，尤其是在雙通等情況下，成對信號點(diǎn)之間的距離很小，這對于物鏡的分辨率就提出很高的要求。明美MF43-M采用高品質(zhì)半復(fù)消色差熒光物鏡，具有高透光率與高數(shù)值孔徑，成像效果好，分辨率高。
 

明美方案

（1）完整FISH熒光原位雜交成像，配套FISH分析系統(tǒng)方案

推薦：熒光顯微鏡MF43-M（醫(yī)療器械型號）+顯微相機(jī)MC50-S/MS23+熒光光源MG-100/MG-120/MG-200
 

 

 ▪ 配備6孔落射熒光模塊與大功率LED熒光光源，使用方便激發(fā)效果好

 ▪ 高品質(zhì)Chroma濾光片，截止深度大，信噪比高，參數(shù)可按需配置

 ▪ 高性能主機(jī)架，熒光透過率高，低雜散光，機(jī)身穩(wěn)定，調(diào)焦準(zhǔn)確順滑

 ▪ 高數(shù)值孔徑半復(fù)消色差熒光物鏡，熒光信號強(qiáng)，成像清晰

 ▪ 高靈敏度與低讀取噪聲熒光顯微相機(jī)，弱熒光成像效果好

 ▪ 獲醫(yī)療器械注冊的專業(yè)FISH圖像分析處理軟件，使用方便，功能強(qiáng)大

 

（2）已有四大品牌無限遠(yuǎn)顯微鏡，升級FISH分析系統(tǒng)

推薦：四大品牌無限遠(yuǎn)顯微鏡 + 明美六孔熒光模塊 + 熒光光源MG-100/MG-120/MG-200 +顯微相機(jī)MC50-S/MS23

 

 ▪ 適合四大品牌無限遠(yuǎn)光學(xué)顯微鏡升級

 ▪ 專業(yè)六孔熒光模塊，激發(fā)塊可按需選擇，擴(kuò)展性強(qiáng)

 ▪ 方便易用，超長壽命的LED熒光光源

 ▪ 高靈敏度的FISH專用顯微鏡相機(jī)，搭配專業(yè)FISH圖像分析處理軟件

 

（3）已有四大品牌熒光顯微鏡，升級LED熒光光源

推薦：MG-100/MG-120/MG-200
 

 

 ▪ 可匹配四大品牌主流熒光顯微鏡

 ▪ 覆蓋熒光激發(fā)光譜，亮度高，激發(fā)效果穩(wěn)定

 ▪ 觸屏控制器，操作直觀簡單

 ▪ 壽命長，即開即用，維護(hù)簡單

 ▪ MG-200液冷散熱，提供更接近汞燈的光強(qiáng)，尤其加強(qiáng)G波段

 

明美是國家高新技術(shù)企業(yè)，創(chuàng)立至今已20年，專注于顯微鏡以及顯微成像系統(tǒng)產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和銷售，致力于顯微成像領(lǐng)域的自動(dòng)化、數(shù)字化、智能化；明美迄今已為全球10萬+的用戶提供過產(chǎn)品以及服務(wù);明美曾屢獲國家創(chuàng)新基金支持，被廣東省科技廳認(rèn)定為顯微成像工程技術(shù)研究中心。

 

公司以品質(zhì)謀發(fā)展，以服務(wù)為宗旨，連續(xù)11年獲守合同重信用企業(yè)認(rèn)證，已通過ISO9001質(zhì)量管理體系、ISO14001環(huán)境管理體系、ISO13485醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系和知識產(chǎn)權(quán)管理體系認(rèn)證，擁有二類醫(yī)療器械生產(chǎn)資質(zhì)，獲得近百個(gè)專利和軟件著作權(quán)。

 

明美總部位于廣州，在全國20余個(gè)大中城市均設(shè)有服務(wù)網(wǎng)點(diǎn)，提供完善的專業(yè)服務(wù)。

 

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