吳燕嬌 冉良驥

細胞培養(yǎng)是細胞和分子生物學所使用的一項重要技術，為細胞正常生理和生化研究（如代謝研究、衰老研究）、藥物和毒性化合物對細胞的作用、以及致突變性和致癌性研究提供了上佳的模型系統(tǒng)。細胞培養(yǎng)還可用于藥物篩選和開發(fā)，以及生物化合物（如疫苗、治療性蛋白質）的大規(guī)模生產。自從1955年Harry Eagle博士在《Science》雜志上發(fā)表研究文章并發(fā)布“一個包含無機鹽、糖、氨基酸、維生素及其他必須營養(yǎng)物質的等滲透壓且具有pH緩沖能力的混合物”細胞基礎培養(yǎng)基配方以來，眾多生物制藥團隊對培養(yǎng)基的開發(fā)與優(yōu)化從未停下腳步。2000年后，化學成分明確的細胞培養(yǎng)基，逐漸成為細胞培養(yǎng)基開發(fā)的主流，用以支持高密度培養(yǎng)及高產物表達的研究。

以賽默飛Gibco™細胞培養(yǎng)基為例，經過嚴格的工藝控制和污染檢測，其質量、安全性、批間一致性和合規(guī)性均得到保證，可以滿足客戶從基礎研究到放大生產的特定細胞培養(yǎng)需求。

賽默飛Gibco細胞培養(yǎng)基系列產品

不同類型的培養(yǎng)細胞

通常培養(yǎng)基的成分和配比需要進行針對性的調整，才能滿足不同培養(yǎng)底物的生長需求。PaulJ.Price[1]在2017年發(fā)表的一篇文獻就詳細的描述了培養(yǎng)基的成分對細胞生長的影響。在本文中，我們嘗試結合Thermo Scientific™ Vanquish™ Duo液相色譜及Thermo Scientific™ CAD電霧式檢測器對培養(yǎng)基中各類基礎組分進行了分析，可以作為培養(yǎng)基生產研發(fā)企業(yè)與生物醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)的參考。

本方案分為四個液相方法。方法1測定培養(yǎng)基中的糖，方法2測定培養(yǎng)基中的核苷酸，方法3測定培養(yǎng)基中的氨基酸，方法4測定培養(yǎng)基中的維生素。大部分氨基酸紫外吸收較弱，通常需要經過合適的衍生試劑經衍生化反應增加發(fā)色團后，再使用UV檢測器進行測定。由于衍生化反應操作比較繁瑣、以及對衍生化效率、氨基酸衍生物穩(wěn)定性方面的考慮，我們采用CAD電霧式檢測器對氨基酸進行不衍生直接測定。CAD檢測器較傳統(tǒng)紫外檢測器、ELSD檢測器等有著獨特的優(yōu)勢，分析物既不需要發(fā)色團也不需要離子化，適用于不揮發(fā)及半揮發(fā)化合物的高靈敏度檢測，可以實現(xiàn)糖與氨基酸高靈敏度檢出。培養(yǎng)基成分復雜，需要采用不同的檢測器分析不同的組分，在一定程度上可能會影響實驗效率，賽默飛Vanquish Duo液相特有的雙泵、雙針自動進樣器，則可以實現(xiàn)一套儀器兩條流路(left、right system)獨立運行，無污染無干擾且高效的進行分析，有效解決分析痛點的同時，同時獲得事半功倍的效果。

Vanquish CAD示意圖

Vanquish Duo液相系統(tǒng)連接示意圖及并聯(lián)工作流程

 

方法一：

每一個生長培養(yǎng)基都需要碳源，以供細胞新陳代謝。碳源通常是葡萄糖，也可以是其他糖類，如半乳糖、己糖、蔗糖、果糖或其他碳源(如丙酮酸，谷氨酰胺)等。采用Vanquish液相系統(tǒng)及CAD電霧式檢測器測定培養(yǎng)基中葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等組分。

乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖CAD測定圖譜

方法二：

在低血清、無血清細胞培養(yǎng)基中，為滿足細胞生長增殖需要，常常添加一些成份：蛋白質、多肽、核苷、嘌呤、檸檬酸循環(huán)的中間產物、脂類、及一些血清替代因子等。隨著細胞的不斷分裂，DNA不斷復制，細胞內部原有的的核苷酸不足以保證DNA的順利完成復制時，就必須要從培養(yǎng)基中攝取核苷酸供細胞的DNA復制需要。采用Vanquish Duo HPLC系統(tǒng)，Hypercarb石墨化碳色譜柱，UV檢測器測定5種核苷酸。

五種核苷酸測定圖譜

方法三：

所有的培養(yǎng)基配方含有10種必需氨基酸以及半胱氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸。在一些培養(yǎng)基中還需要加入其他非必需氨基酸(丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸)，可以減少細胞的代謝負擔，從而達到細胞增殖的目的。采用CAD電霧式檢測器與Hypercarb石墨化碳色譜柱無需衍生直接測定培養(yǎng)基中20種氨基酸。

氨基酸無需衍生電霧式檢測器直接測定培養(yǎng)基中20種氨基酸譜圖

氨基酸測定線性圖譜

方法四：

維生素是維持細胞生長的生物活性物質，在細胞代謝中起調節(jié)及控制作用。水溶性維生素主要包括泛酸、維生素B12、葉酸、煙酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黃素、維生素C、膽堿、肌醇等。賽默飛Vanquish液相結合紫外檢測器，可以有效檢測培養(yǎng)基中水溶性維生素。

水溶性維生素測定圖譜

 

結論：

Vanquish Duo搭配紫外、CAD等檢測器，可以高效、靈活地解決培養(yǎng)基中各類基礎組分分析的難題。與質譜方案相比， Vanquish Duo液相結合CAD檢測器的并聯(lián)分析方案能有有效降低儀器配置成本，人員操作難度，更適合在QC實驗室進行推廣。
 

參考文獻：

[1]. Price, P. J. (2017). Best practices for media selection for mammalian cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 53(8), 673–681. doi:10.1007/s11626-017-0186-6

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