細胞名稱：MCF 10A(人正常乳腺上皮細胞)
細胞別稱： MCF 10A; MCF.10A; MCF10A; MCF10a; MCF-10 Attached; Michigan Cancer Foundation-10A
細胞貨號:   SNL-225
生長特性:   貼壁
培養(yǎng)條件:   DMEM+10% FBS+20ng/mL EGF+0.5μg/mL Hydrocortisone+10μg/mL Insulin+1% NEAA+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境:   空氣，95%；二氧化碳 (CO₂)，5%；37℃
細胞簡介:   MCF 10A細胞于1984年從患有纖維囊性乳房的36歲白人女性的乳腺中分離出來，來源于群體中的粘附細胞，是一種非致瘤性上皮細胞系。MCF 10A細胞通過電子顯微鏡觀察，顯示出管腔導(dǎo)管細胞的特征，而不是肌上皮細胞的特征，同時培養(yǎng)基中的鈣含量對細胞的形態(tài)有很大影響。MCF 10A細胞上皮唾液粘液、細胞角蛋白和乳脂球抗原呈陽性，還表達通過與MFA乳腺和MC-5單克隆抗體的陽性反應(yīng)檢測到的乳腺特異性抗原。MCF 10A細胞在膠原蛋白中表現(xiàn)出三維生長，并在融合培養(yǎng)物中形成圓頂。到目前為止，細胞還沒有表現(xiàn)出終末分化或衰老的跡象。MCF 10A細胞對胰島素、糖皮質(zhì)激素、霍亂腸毒素和表皮生長因子（EGF）有反應(yīng)。MCF 10A細胞可以用于3D細胞培養(yǎng)，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。

   
01 消化時間長
MCF10A細胞消化時間較長，通常需要5min或者更久，具體時間因胰酶濃度、效價、消化條件有所不同，第一次對該細胞進行消化時要摸索最佳時間（具體步驟見后文）。
02對培養(yǎng)基要求高
培養(yǎng)基中胰島素、氫化可的松、表皮生長因子、非必須氨基酸等成分對MCF10A的生長有著關(guān)鍵作用，必須添加這些因子才能正常培養(yǎng)。

   
1.準備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）
2. 抽走培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加5mL PBS潤洗1-2遍，清除殘留培養(yǎng)基；
3. 盡量吸干潤洗的PBS后加1mL胰酶，搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底，放置培養(yǎng)箱37℃消化；
4. 消化時每隔1-2min拿出來觀察，鏡下可見細胞明顯回縮，輕拍培養(yǎng)瓶部分細胞開始脫落時，吸取瓶中胰酶將細胞都吹下來，然后加入3-4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻后立刻離心；
 
Tips：
注意控制吹打力度輕柔，吹打次數(shù)不可過多，避免機械損傷
細胞部分脫落后先用胰酶將細胞都吹下來再終止消化，避免細胞重新貼壁
 
5. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm，3min離心收集細胞；
6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦15mL）
7. 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣；
Tips：推薦傳代比例1:2-1:4，首次傳代建議1:2。細胞生長至80%密度時即可傳代。

   
1. 配制程序性凍存液，準備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標記。
Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完全培養(yǎng)基+8%DMSO
2. 先將細胞按傳代步驟消化、離心、棄上清，獲得細胞沉淀；
3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中；
4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
5. 轉(zhuǎn)移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置
Tips：
液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存。
程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。
T25培養(yǎng)瓶長滿通�？蓛龃�2-3管，10cm皿長滿通�？蓛龃�3-4管。
凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細胞狀態(tài)不佳。

   
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機設(shè)置好轉(zhuǎn)速；
2. 將細胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴，融化過程不超過2min；
Tips：
若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。
凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會待液氮完全蒸發(fā)后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。
水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。 

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異
4. 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
5. 復(fù)蘇24小時后觀察細胞貼壁情況。
Tips：
1. 整個細胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
2. 該細胞貼壁需要穩(wěn)定的環(huán)境，復(fù)蘇完成后請勿頻繁將細胞拿出觀察。

   
▶常溫細胞
1. 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；
 
2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首次傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；
▶凍存細胞
1. 細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完全揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決；
 
2. 凍存細胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；
3. 復(fù)蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作；
Tips：
1. 細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完全揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；
2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應(yīng)細胞的完全培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng)；

   
NO.1細胞密度怎么計算的？
嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴謹，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式。
 
NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？
1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
 
NO.3細胞具體消化時間是多久？
每個實驗室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完全規(guī)定消化時間，以實際消化效果和實驗經(jīng)驗為準。 

▶產(chǎn)品
【SNL-225】 MCF 10A(人正常乳腺上皮細胞)
【SNLM-225】MCF 10A細胞專用完全培養(yǎng)基