近些年，隨著生物醫(yī)藥迅猛發(fā)展、疫情下細(xì)胞基因治療以及mRNA疫苗的相繼涌現(xiàn)，如何把控生物制品安全可靠，成為各國法規(guī)政府重視以及監(jiān)管的要點(diǎn)。支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對(duì)于涉及細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程，法規(guī)要求“必須確保無支原體污染”。

監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求的支原體檢測點(diǎn)

2020版中國藥典三部《生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制》中提出對(duì)于生產(chǎn)用細(xì)胞，需要對(duì)主細(xì)胞庫（MCB）、工作細(xì)胞庫（WCB）、生產(chǎn)終末細(xì)胞（EOPC）進(jìn)行支原體檢查。

《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中建議在關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)對(duì)適合的中間樣品開展支原體等安全性相關(guān)檢測或采取相關(guān)的措施加以控制，并且支原體同樣需要作為終產(chǎn)品的放行檢項(xiàng)。

FDA,Guidance for Industry:Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，中提出對(duì)于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進(jìn)行支原體控制。

NAT法和傳統(tǒng)方法

在快速檢測方法（NAT，核酸擴(kuò)增技術(shù)）出現(xiàn)之前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法因其檢測周期長或靈敏度問題，致使企業(yè)生產(chǎn)或產(chǎn)品放行周期拉長或者需要基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估對(duì)細(xì)胞原料進(jìn)行條件放行或者尋求其他替代方法。而隨著細(xì)胞基因治療的發(fā)展，行業(yè)內(nèi)對(duì)支原體檢測時(shí)效性和靈敏度要求越來越高，短的貨架期不足以支撐如此長的檢測周期，因此NAT方法從眾多支原體檢測方法中脫穎而出。

目前歐洲藥典（EP）<2.6.7>，日本藥典（JP）以及美國藥典（USP）<63>都已收錄NAT方法作為支原體檢測方法，但需要對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證以及與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比其檢測靈敏度不低于傳統(tǒng)方法，才可以使用。2020版中國藥典（ChP）雖然并未收錄NAT法作為支原體檢測方法，但其中也提到了“也可采用經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他方法”。2022年5月，國家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中提到“當(dāng)檢驗(yàn)樣品量有限，或需要快速放行等特殊情況下，如藥典方法無法滿足，可考慮開發(fā)新型的無菌和支原體的檢測方法進(jìn)行放行檢測，但是新型檢測方法應(yīng)經(jīng)過充分驗(yàn)證”。所以NAT法有望作為能夠支持快速支原體放行檢測的方法，被越來越多的原材料供應(yīng)商、以及ATMP企業(yè)所使用。

NAT法-方法驗(yàn)證要求

對(duì)于如何進(jìn)行NAT方法的驗(yàn)證，目前歐洲藥典<2.6.7>和日本藥典里都詳細(xì)介紹，其內(nèi)容基本一致。中檢院也發(fā)表了文章《支原體檢查的核酸檢測方法及方法學(xué)驗(yàn)證的思考》，以期對(duì)我國支原體核酸擴(kuò)增法檢測的研發(fā)者及使用者提供借鑒。支原體NAT法須進(jìn)行專屬性（Specificity）、檢測限（Detection Limit）和耐用性（Robustness）驗(yàn)證。如果使用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行支原體檢測，則可以基于供應(yīng)商的完整試劑盒性能驗(yàn)證報(bào)告再結(jié)合本身實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和樣品類型進(jìn)行合適的方法適用性驗(yàn)證。

專屬性（Specificity）

專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。EP中提到需要在驗(yàn)證中關(guān)注與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較近的其他細(xì)菌種屬之間的交叉反應(yīng)，如革蘭氏陽性菌包括梭菌屬Clostridium、乳桿菌屬Lactobacillus和鏈球菌屬Streptococcus。當(dāng)然也需要關(guān)注宿主細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境中比較常見的如人源DNA污染類型。

檢測限（Detection Limit）

檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。檢測限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，不需要被準(zhǔn)確定量為一個(gè)準(zhǔn)確值。EP中要求每種支原體每個(gè)稀釋濃度都需要有24次檢測數(shù)據(jù)，可以在不同天做3次獨(dú)立的10倍系列梯度稀釋，每個(gè)稀釋梯度做8次重復(fù)檢測；或者可以選擇不同天做4次獨(dú)立的10倍系列梯度稀釋，每個(gè)稀釋梯度做6次重復(fù)檢測。檢測陽性率需要滿足95%以上可以作為檢測限。

對(duì)需要進(jìn)行檢測限確認(rèn)的支原體類型，試劑盒廠家需盡可能多的覆蓋法規(guī)藥典中要求的支原體類型，并需要對(duì)每種支原體的檢測限進(jìn)行摸索。而對(duì)于生物制品企業(yè)來說，通常需要根據(jù)實(shí)際使用的原輔料來源進(jìn)行選擇。另外建議把人源支原體類型考慮進(jìn)去。

如果在生產(chǎn)過程中使用或接觸禽細(xì)胞或材料，應(yīng)進(jìn)行滑液囊支原體的檢測限驗(yàn)證；
如果在生產(chǎn)過程中使用或接觸昆蟲或植物材料，應(yīng)進(jìn)行螺原體的檢測限驗(yàn)證；
豬鼻支原體在支原體污染樣本中占比非常高，受到中國食品藥品檢定研究院的關(guān)注。

相比于歐洲藥典，日本藥典中對(duì)于需驗(yàn)證檢測限的支原體中，并未提到雞毒支原體而是增加了唾液支原體。

耐用性（Robustness）

耐用性系指在測定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。對(duì)于耐用性的評(píng)估，需要關(guān)注支原體檢測方法對(duì)于檢測試劑中MgCl2、引物和dNTP的濃度變化，核酸提取試劑盒或提取步驟的改變以及使用不同核酸擴(kuò)增儀的耐受程度。

可比研究（Comparability Study）

如果要使用NAT替代藥典方法，則需要通過對(duì)比確認(rèn)NAT法能夠替代培養(yǎng)法或者指示細(xì)胞培養(yǎng)法，通常需要考慮方法的檢測限，同時(shí)也需要把專屬性（如覆蓋的支原體范圍以及可能的假陽性）考慮進(jìn)去。對(duì)于檢測限的對(duì)比，需滿足“檢測限達(dá)到10 CFU/mL，可以替代培養(yǎng)法；檢測限達(dá)到100 CFU/mL，可以替代指示細(xì)胞培養(yǎng)法”。

進(jìn)行可比研究有2種可選的方式：

1. 使用相同驗(yàn)證支原體菌株，同時(shí)進(jìn)行NAT法和藥典方法的同步實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)檢測限；

2. 使用NAT法驗(yàn)證結(jié)果與之前的藥典方法驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，但對(duì)于2種方法中使用的支原體標(biāo)準(zhǔn)品的確認(rèn)文件需要仔細(xì)記錄。
 

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