由于全球氣候變化，大多數(shù)農(nóng)田栽培的作物都有面臨嚴重脅迫的風險，使農(nóng)業(yè)產(chǎn)量大大降低。通過成像技術(shù)對作物進行感知，可以在早期階段檢測到生物或非生物脅迫，從而避免損害和重大減產(chǎn)。葉綠素a熒光成像技術(shù)是用于植物脅迫檢測的專業(yè)技術(shù)之一，具有廣泛的國際認可度。它可以評估葉片的時空變化，在出現(xiàn)任何肉眼可見癥狀之前就能對植物生理狀態(tài)進行癥狀前監(jiān)測，從而實現(xiàn)高通量評估。在此，我們將舉例說明如何利用葉綠素a熒光成像分析來評估生物和非生物脅迫。葉綠素a能夠在甜菜夜蛾攝食后15分鐘、西紅柿植株感染灰霉病后30分鐘檢測生物脅迫，或缺水脅迫開始時檢測非生物脅迫，因此具有早期脅迫檢測的強大潛力。葉綠素熒光(ChlF)分析是一種快速、非侵入性、易操作、低成本和高靈敏度的方法，可估測光合作用性能并檢測各種脅迫對植物的影響。在 ChlF 參數(shù)方面，開放的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心的比例(qP)可用于早期脅迫檢測，因為最近的許多研究發(fā)現(xiàn)它是基于ChlF篩選環(huán)境脅迫對植物影響的最準確和最合適的指標。
 

光合作用的光反應(yīng)
葉綠素是通過捕光天線吸收光能的主要分子。在光合作用的光反應(yīng)中，捕光天線吸收的光能會被光化學反應(yīng)轉(zhuǎn)化成電子進行傳遞，電子從光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）通過細胞色素b6f和質(zhì)體藍蛋白（PC）轉(zhuǎn)移到光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ），最終生成NADPH。除此之外，光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）作為一種大型色素-蛋白質(zhì)復合物，還負責光合生物中水的光依賴性氧化，釋放分子氧并向類囊體膜內(nèi)釋放質(zhì)子（H⁺）。質(zhì)子最終通過ATP合酶，合成ATP。NADPH和ATP均可用于光合作用的暗反應(yīng)中CO₂的固定和有機物的合成。
 

光反應(yīng)的產(chǎn)物ATP和NADPH必須與碳水化合物和其他必需有機分子的合成相協(xié)調(diào)。否則，會產(chǎn)生活性氧（ROS）。在光能轉(zhuǎn)化為化學能的過程中，活性氧（ROS）在低水平上不斷形成，但它們被不同的抗氧化機制清除。這些 ROS 是單線態(tài)激發(fā)氧（¹O₂）、過氧化氫（H₂O₂）和超氧陰離子自由基（O₂^-）。過量的光能吸收肯定會使電子傳遞鏈容量過度飽和，導致ROS形成的可能性增加。生物和非生物脅迫，如干旱、鹽度、金屬毒性、冷卻、UV-B 輻射、昆蟲和病原體都導致ROS（H₂O₂， O₂^-,  ¹O₂，OH）在植物體內(nèi)產(chǎn)生的量增加，這是由于細胞穩(wěn)態(tài)的破壞，可導致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是由酶促和非酶促抗氧化劑的ROS產(chǎn)生和清除之間的不平衡引起的。這種不平衡會導致細胞損傷，從而導致細胞死亡。因此，植物需要在細胞結(jié)構(gòu)破壞之前對這種不平衡做出反應(yīng)，以維持光合活性和全株存活。

葉綠體是植物細胞中ROS最重要的創(chuàng)造者，尤其是光合作用的光反應(yīng)。在大多數(shù)環(huán)境脅迫條件下，吸收的光能超出其可控制的量，因此會損害葉綠體。保護光合設(shè)備免受導致ROS產(chǎn)生的過量光能的過程是非光化學淬滅（NPQ）的機制。植物已經(jīng)發(fā)展了幾種光保護機制，包括光通過葉片和葉綠體運動逸出，NPQ機制通過吸收的光能作為熱能耗散，PSⅠ周圍的循環(huán)電子傳輸，光呼吸途徑和ROS清除系統(tǒng)。NPQ的產(chǎn)生可以避免在環(huán)境脅迫條件下經(jīng)常觀察到的ROS生成增加。然而，酶促和非酶促抗氧化機制可以消除環(huán)境脅迫條件下ROS生成的增加。

葉綠素熒光分析方法分辨率高、快速、無損、成本低，可以通過監(jiān)測PSⅡ的葉綠素熒光發(fā)射來評估光化學的任何變化。該方法可以準確地確定用于光化學的能量(Φ_PSⅡ)，以熱量(Φ_NPQ)，或非穩(wěn)壓耗散在 PSⅡ中(Φ_NO)。
 

葉綠素a熒光分析的基礎(chǔ)知識
植物的葉綠素熒光來自吸收的光能中的一小部分重新以光的形式發(fā)射，葉綠素熒光可以用來解釋植物能量轉(zhuǎn)換相關(guān)的為光合作用活性，為光合裝置，特別是PSⅡ提供了有價值的見解。葉綠素分子（Chl）吸收光能將其轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)（Chl*），其能量較高，具體取決于用于照明的光波長。激發(fā)的葉綠素分子（Chl*）可以以兩種激發(fā)態(tài)存在：單態(tài)葉綠素分子（¹Chl*），具有相對短的壽命以及壽命更長的三態(tài)葉綠素分子（³Chl*）。單線態(tài)激發(fā)態(tài)葉綠素分子（¹Chl*）可以通過（i）耗散能量為熱(NPQ)，（ii）將能量轉(zhuǎn)移到另一個電子受體分子，稱為光化學（qP），或（iii）以熒光的形式重新發(fā)射為光，葉綠素熒光波長比吸收光更長。在這些途徑中，可用于去激發(fā)¹Chl*的是光化學反應(yīng)，它將光能轉(zhuǎn)化為電子傳遞用于合成化學產(chǎn)物。當光合作用高效進行時，觀察到的熒光很少。在以下情況下¹Chl*不是通過上述途徑去激發(fā)的，它是從高能激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)換而來的1Chl* 至低能激發(fā)態(tài)³Chl*通過內(nèi)部轉(zhuǎn)換或松弛。三態(tài)葉綠素分子（³Chl*）能與分子O₂反應(yīng)產(chǎn)生單氧（¹O₂*），一種非常活潑的活性氧（ROS）。在環(huán)境溫度下，大多數(shù)熒光來自與PSⅡ相關(guān)的葉綠素a分子。
 

測量葉綠素a熒光
葉綠素a熒光可以使用各種方法進行檢測，例如脈沖振幅調(diào)制(PAM)方法。在開始測量之前，葉片必須經(jīng)過幾分鐘或者幾十分鐘的暗適應(yīng)，這取決于測量前葉子所處光環(huán)境的光強度和植物物種。黑暗中葉綠素a熒光的最小水平Fo通過低強度測量光ML獲得，而暗適應(yīng)葉片的最大熒光產(chǎn)量Fm則用飽和光脈沖SP進行評估。在光化光照明AL（即施加的光強度）下，可以使用另一個飽和脈沖估計光適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光Fm′。在施加的光化光AL關(guān)閉之前測量熒光的穩(wěn)態(tài)水平Fs。除此之外，在關(guān)閉AL后，開可以測到另一個葉綠素熒光的最低水平Fo′。Fm′和Fo′之間的差異是光下的最大可變熒光Fv′。根據(jù)這些測量的基本葉綠素熒光參數(shù)，可以計算出其他一些更常用于葉綠素熒光分析的參數(shù)。

葉綠素熒光成像用于非生物應(yīng)激檢測

水分充足（對照）的擬南芥（a）和缺水脅迫開始時（對照植株土壤容積含水量的 95-96%, SWC）的擬南芥（b）葉片上開放的 PSⅡ 反應(yīng)中心（qP）的差異。右側(cè)的顏色代碼表示qP值，范圍從0到1。

 

在0 µM（對照）、40 µM或 120 µM Cd²⁺ 脅迫條件下生長3天和4天的Noccaea caerulescens植株。圖中顯示了開放的PSⅡ反應(yīng)中心的比例（qP）。右側(cè)的顏色代碼顯示 qP值的范圍為0.0至1.0。

 

Noccaea caerulescens中開放的PSⅡ反應(yīng)中心部分（qP）對鎘暴露的U型雙相響應(yīng)曲線。在 40 µM 的鎘濃度下暴露3天后，觀察到開放的 PSⅡ 反應(yīng)中心(qP)的比例下降，而暴露時間更長(4 d)后，由于誘導了應(yīng)激防御反應(yīng)，qP增加。同樣的120 µM Cd暴露時間（3天）導致qP增加。這種激素反應(yīng)被認為是由ROS水平的增加引發(fā)的，而ROS 被認為有利于引發(fā)防御反應(yīng)。

 

生物脅迫下番茄葉片的葉綠素熒光成像結(jié)果。其中每個像素的顏色代表 Spodoptera exigua 幼蟲取食前（a）和取食15分鐘后（b）番茄小葉中Fm（暗適應(yīng)最大葉綠素a熒光）。(a)中用圓圈表示取食前的十個感興趣區(qū)域（AOIs），(b)中為相同的感興趣區(qū)域、兩個取食點（星號表示）和另外五個感興趣區(qū)域（箭頭表示）。白色箭頭所指的取食點覆蓋了整個 AOI。黑色箭頭指向現(xiàn)有AOI附近的周圍區(qū)域。AOI 的圓圈上有紅色標簽，標注了其所在位置的Fm值。右側(cè)的顏色代碼顯示Fm值的范圍為0.0至0.4。

 

茄科植物小葉在被Spodoptera exigua幼蟲取食前（0分鐘）和取食 15、90和180分鐘后的Φ_PSⅡ、Φ_NPQ和Φ_NO的彩色圖片。取食前的AOIs用圓圈表示，而相同的AOIs、三個取食點的AOIs（用星號和箭頭表示）以及取食區(qū)周圍的AOIs區(qū)則用圓圈表示。AOI的圓圈上還用紅色標簽標注了相應(yīng)的參數(shù)值。右側(cè)的顏色代碼顯示了參數(shù)值的范圍為0.0至0.5。

在植物表型分析中利用現(xiàn)有成像工具具有巨大潛力，可以加快我們對植物功能的認識。這些工具可以建立基因功能與環(huán)境反應(yīng)之間在代謝、生化和信號轉(zhuǎn)導過程等多個途徑上的聯(lián)系。在這些工具中，葉綠素熒光成像(ChlF Imaging)分析是一種快速、非侵入性、高成本效益和高靈敏度的方法。這種方法能精確估計光合作用的性能，并能檢測植物受到的各種脅迫影響。葉綠素熒光成像作為一種在肉眼可見的癥狀出現(xiàn)之前檢測生物和非生物脅迫的技術(shù)，其潛力已在園藝領(lǐng)域得到證實，并已有效地應(yīng)用于采收前和采收后的各種情況。葉綠素熒光成像作為一種技術(shù)，對于研究生物和非生物脅迫因素下葉片光合作用的異質(zhì)性特別有價值，而且還能篩選大量樣本，提供早期脅迫檢測診斷。然而，該領(lǐng)域的進一步研究仍然至關(guān)重要，其最終目的是加快農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。葉綠素熒光分析方法可用于構(gòu)建各種作物品種的綜合脅迫耐受性數(shù)據(jù)庫，以便根據(jù)環(huán)境條件優(yōu)化光合功能，應(yīng)對氣候變化，從而提高作物產(chǎn)量。

在各種葉綠素熒光成像的參數(shù)中，開放的PSⅡ反應(yīng)中心的比例（qP）被認為是最適合用于早期脅迫檢測的指標。最近的研究一致發(fā)現(xiàn)qP具有很高的靈敏度，非常適合用于探測光合作用的功能，可在早期評估非生物和生物脅迫對植物的影響。我們建議科學家在進一步的研究中考慮將QA 氧化還原狀態(tài)的葉綠素熒光參數(shù)納入其工作中。
本研究中葉綠素熒光成像的圖片由IMAGING-PAM獲得。

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