腺相關(guān)病毒 (Adeno-associated virus，AAV) 因其低免疫原性、低基因毒性、在多種不同組織類型具有持久基因表達(dá)、作用時(shí)間長(zhǎng)以及易于生產(chǎn)等特性，成為了臨床基因治療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的基因治療載體^[1]。AAV病毒屬于細(xì)小病毒家族，無(wú)包膜，由衣殼蛋白和單鏈DNA（全長(zhǎng)4.7kb）組成。不同血清型的AAV均由三種不同的衣殼病毒蛋白（VP：VP1（～80 kDa），VP2（～65 kDa）和VP3（～60 kDa））按照摩爾比約1:1:10組裝成二十面體結(jié)構(gòu)^[2]。衣殼蛋白除保護(hù)病毒基因組外，在介導(dǎo)受體結(jié)合、病毒逃逸，將病毒DNA運(yùn)送至靶標(biāo)細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。衣殼蛋白序列或者翻譯后修飾的改變，均可影響病毒載體的靶向性和感染性^[3]。
 
因此，確保AAV藥物應(yīng)用于人基因治療的有效性和安全性，對(duì)AAV載體質(zhì)量屬性進(jìn)行監(jiān)控具有重要意義。相較于治療性蛋白，大多數(shù)AAV樣本蛋白質(zhì)濃度低（0.01-0.1mg/mL），可用于分析的樣本量有限，給AAV表征分析帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)^[4]。微流速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Microflow LC/MS-MS）系統(tǒng)以其高通量、穩(wěn)定的分析性能，兼具良好的靈敏度等特點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、生物制品表征分析^[5]。
   
本研究中，SCIEX合作中國(guó)食品藥品檢定研究院重組室，應(yīng)用微升流速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（Microflow LC-MS/MS）對(duì)低濃度的AAV2衣殼蛋白（8×10¹¹ GC/mL）進(jìn)行表征分析，發(fā)表在期刊《Applied Biochemistry and Biotechnology》上。通過(guò)數(shù)據(jù)依賴型采集（Information dependent acquisition，IDA）技術(shù)進(jìn)行肽圖分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)AAV2衣殼蛋白將近100%的序列覆蓋度，同時(shí)獲得超過(guò)30個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)鑒定和相對(duì)定量信息。通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離（CID）技術(shù)，獲得高質(zhì)量二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)氨基酸序列完整匹配，以及應(yīng)用電子活化解離EAD技術(shù)實(shí)現(xiàn)氨基酸同分異構(gòu)體區(qū)分。微升流速液相色譜（Microflow LC）系統(tǒng)聯(lián)合ZenoTOF^® 7600 系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)高通量、穩(wěn)定分析的同時(shí)，兼具良好靈敏度，為大批量、低濃度生物制品樣本表征分析提供技術(shù)支撐。
    

---

  
AAV2衣殼蛋白序列覆蓋度分析
 
ZenoTOF^® 7600 系統(tǒng)，Zeno^™ trap，將占空比提高到大于90%，減少離子損失，實(shí)現(xiàn)更高的MS/MS靈敏度。結(jié)合具有穩(wěn)定、高通量，同時(shí)兼具良好靈敏度的微升流速液相色譜系統(tǒng)對(duì)低樣本量的AAV2樣本進(jìn)行分離，在提升分析靈敏度的同時(shí)，獲得高質(zhì)量的二級(jí)譜圖。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配分析，AAV2衣殼蛋白序列覆蓋度將近100%（圖1）。其中通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)匹配的序列達(dá)95%，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)匹配的序列為5%。
 
 
 
AAV2衣殼蛋白翻譯后修飾分析
 
Biologics Explorer^™ 軟件通過(guò)預(yù)建立的分析流程，在數(shù)據(jù)庫(kù)匹配分析模塊設(shè)置翻譯后修飾類型，實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾位點(diǎn)快速、流程化鑒定和定量分析。應(yīng)用Biologics Explorer^™ 軟件分析，在AAV2衣殼蛋白中共鑒定到32個(gè)修飾位點(diǎn)（表1），修飾類型包括脫酰胺、氧化、乙�；�修飾。其中相對(duì)豐度 >1%的PTMs有20個(gè)。相對(duì)豐度 <1%的PTMs有11個(gè)，如N317、Q319、Q464的脫酰胺修飾，A2和L315乙酰化修飾。
 
應(yīng)用高靈敏度的微升流速液相色譜系統(tǒng)和Zeno^™ trap技術(shù)，在實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度翻譯后修飾肽段分析的同時(shí)，獲得肽段高質(zhì)量的二級(jí)質(zhì)譜圖，實(shí)現(xiàn)肽段序列完整匹配。圖2分別展示了在第464位和第614位的谷酰氨（Q）發(fā)生脫酰胺修飾肽段LQFSQAGASDIR（圖2A）和DVYLQGPIWAK（圖2B）的Native和脫酰胺修飾兩種形式的提取離子色譜圖。兩條肽段脫酰胺修飾形式的相對(duì)豐度均很低，其相對(duì)豐度分別僅為0.07% (LQFSQAGASDIR) 和0.38% (DVYLQGPIWAK) 。
 
  
  
蛋白質(zhì)脫酰胺化是天冬酰胺殘基側(cè)鏈發(fā)生脫酰胺反應(yīng)形成天冬氨酸（Asp）或異天冬氨酸（isoAsp）。AAV載體的脫酰胺化可影響衣殼蛋白組裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，以及影響其組織趨向性和衣殼蛋白與免疫系統(tǒng)的互作^[6]。碰撞誘導(dǎo)解離（CID）碎裂是常用的質(zhì)譜碎裂技術(shù)，能夠提供氨基酸序列確認(rèn)。然而，其在區(qū)分同分異構(gòu)體，如Asp和isoAsp具有較大挑戰(zhàn)。而電子活化解離（EAD）技術(shù)可產(chǎn)生特征性的診斷碎片離子，實(shí)現(xiàn)氨基酸異構(gòu)體的區(qū)分^[7]。肽段YLGPFNGLDK存在三種脫酰胺修飾形式，EAD二級(jí)圖譜展示（圖3B、D），通過(guò)診斷離子z5-57確定肽段YLGPFNGLDK在保留時(shí)間22.3min和24.8min對(duì)應(yīng)為isoAsp形式。診斷離子z5-44確證保留時(shí)間23.1min對(duì)應(yīng)為Asp形式（圖3C）。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，兩種isoAsp形式，L-isoAsp形式豐度相對(duì)更高^[8,9]。
 

圖3. EAD碎裂模式下，肽段YLGPFNGLDK三種脫酰胺修飾形式XIC圖譜（A）及通過(guò)EAD碎裂產(chǎn)生的診斷離子確定為Asp或isoAsp（B-D）。通過(guò)z5-57診斷離子(綠色標(biāo)注) 確證為isoAsp (B、D)，通過(guò)z-44診斷離子確證為Asp (C) 。
 
 
小結(jié)
 
1 微升流速液相色譜系統(tǒng)具有穩(wěn)定、高通量，兼具良好靈敏度的特性，應(yīng)用微升流速液相色譜系統(tǒng)聯(lián)合ZenoTOF^® 7600 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)低樣本量AAV2衣殼蛋白將近100%氨基酸序列覆蓋分析。
2 Zeno^™ trap 技術(shù)顯著提高二級(jí)質(zhì)譜靈敏度，結(jié)合CID采集技術(shù)獲得高質(zhì)量二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)氨基酸序列高可信度的完整匹配。
3 EAD碎裂技術(shù)提供翻譯后修飾位點(diǎn)準(zhǔn)確定位，以及區(qū)分氨基酸同分異構(gòu)體，為生物制品深度、精準(zhǔn)表征分析提供技術(shù)支撐。
4 Biologics Explorer^™ 軟件提供便捷、流程化的分析工具，實(shí)現(xiàn)包括完整分子量、肽圖分析、翻譯后修飾位點(diǎn)鑒定及相對(duì)定量快速、自動(dòng)化分析。
 
 
參考文獻(xiàn)
[1] Leszek Lisowski., Szun Szun Tay., & Ian Edward Alexander. Adeno-associated virus serotypes for gene therapeutics. Current Opinion in Pharmacology. 2016. 24, 59–67.
[2] R.J. Samulski, N. Muzyczka. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annual Review of Virology. 2014.1: 427–451.
[3] Jin X, Liu L, Nass S, et al. Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis for Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Capsid Proteins. Human Gene Therapy Methods. 2017. 28(5):255-267.
[4] Guapo F, Strasser L, S Millán-Martín, et al. Fast and efficient digestion of adeno associated virus (AAV) capsid proteins for liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) based peptide mapping and post translational modification analysis (PTMs). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2022. 207:114427.
[5] Vowinckel J, Zelezniak A, Bruderer R, et al. Cost-effective generation of precise label-free quantitative proteomes in high-throughput by microLC and data-independent acquisition. Scientific Report. 2018, 8(1):4346.
[6] April R, Giles, Joshua J, et al. Deamidation of Amino Acids on the Surface of Adeno-Associated Virus Capsids Leads to Charge Heterogeneity and Altered Vector Function[J]. Molecular therapy.2018. 26(12): 2848–2862.
[7] Differentiation of aspartic and isoaspartic acid using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note RUO-MKT-02-12550-B.
[8] Comparative analysis of intact AAV8 capsid proteins derived from SF9 and HEK293 cell lines. SCIEX technical note RUO-MKT-02-12917-A.
[9] Marine Morvan and Ivan Miksik. Recent advances in chiral analysis of proteins and peptides. Separations. 2021. 8(8): 112.