胰腺導(dǎo)管腺癌（PDA）是一種高致死性的惡性腫瘤，其發(fā)病率不斷上升，預(yù)后不佳，急需開發(fā)有效的治療PDA的方法。十多年來盡管針對腫瘤代謝的治療一直是研究的重點，但PDA腫瘤代謝的可塑性和潛在毒性限制了這種治療策略。近期來自美國波士頓兒童醫(yī)院的Nada Y. Kalaany 團(tuán)隊利用¹⁵N谷氨酰胺同位素示蹤及代謝組學(xué)技術(shù)揭示胰腺癌細(xì)胞通過鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（OAT）促進(jìn)多胺合成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長的重要機(jī)制，使用OAT抑制劑可有效抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，相關(guān)研究成果發(fā)表于Nature。
 

PDA通過谷氨酰胺生成多胺

作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺氨基上的氮被直接輸送到獨立于尿素循環(huán)的鳥氨酸的從頭合成（DNS）。這種OAT催化的可逆反應(yīng)主要限于嬰兒早期的鳥氨酸和精氨酸合成。相比之下，大多數(shù)成年人的組織傾向于相反的方向，降解鳥氨酸以生成谷氨酸。在成人中，鳥氨酸通常是通過精氨酸酶（ARG1和ARG2）從精氨酸中產(chǎn)生的，既可作為尿素循環(huán)中瓜氨酸合成的底物，也可作為多胺類物質(zhì)的前體，包括腐胺、亞精胺和精胺。這些分子參與了細(xì)胞生長和生存的多個基本過程。那么在PDA中，谷氨酰胺衍生的而非精氨酸衍生的鳥氨酸，是否作可作為一個特殊的多胺來源呢？

首先，通過同位素示蹤法用¹⁵N谷氨酰胺培養(yǎng)人AsPC-1細(xì)胞，結(jié)果顯示，谷氨酰胺的氮未轉(zhuǎn)移到瓜氨酸、精氨酸、精氨酸或尿素中；相反，檢測到其轉(zhuǎn)移到鳥氨酸中，表明DNS的發(fā)生，因為即使尿素循環(huán)是活躍的，這種氮也會被傳遞給尿素而非鳥氨酸，使得DNS成為其轉(zhuǎn)移到鳥氨酸的唯一途徑。谷氨酰胺而非精氨酸被證明是PDA癌細(xì)胞系的鳥氨酸及其多胺衍生物腐胺的主要來源。與PDA癌細(xì)胞系不同，在人類胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞（HPDE）和所有測試的非PDA癌細(xì)胞系中，精氨酸是鳥氨酸和腐胺的主要來源，其中高達(dá)87%的鳥氨酸和80%的腐胺來自¹⁵N-Arg，而只有40%的鳥氨酸和41%的腐胺酸來自¹⁵N-Gln。相比之下，所有PDA細(xì)胞系，除了非KRAS驅(qū)動的BxPC3細(xì)胞系，都更偏好谷氨酰胺：從¹⁵N-Gln中得到的鳥氨酸和腐胺高達(dá)71%，而從¹⁵N-Arg中得到的鳥氨酸和腐胺為35%。這些結(jié)果將PDA（其中90%以上的病例由KRAS驅(qū)動）與正常胰腺細(xì)胞和其他癌癥類型區(qū)分開來，因為它使用谷氨酰胺而非精氨酸作為多胺合成的來源，且這一特征既不是來源于谷氨酰胺分解增強(qiáng)也不是由于其增殖增強(qiáng)。

隨后探究其體內(nèi)變化，給多西環(huán)素誘導(dǎo)的PDA小鼠模型（iKras^G12D）和無腫瘤對照組（iKras^WT）注入¹⁵N-Gln或¹⁵N-Arg。在所有小鼠中，在3小時內(nèi)正常胰腺和腫瘤中分別達(dá)到約54%的¹⁵N-Gln和30-40%的¹⁵N-Arg的富集。且與正常胰腺組相比，PDA腫瘤中¹⁵N-Gln衍生的鳥氨酸和腐胺的合成率及其總量都顯著升高。其中，PDA中谷氨酰胺分別占鳥氨酸標(biāo)記和腐胺標(biāo)記部分的45%和23%，而在正常胰腺中分別占19%和3%。相比之下，精氨酸是正常胰腺組中鳥氨酸（51%）和腐胺（16%）的主要貢獻(xiàn)者，而PDA中只有14%的鳥氨酸和6%的腐胺來自精氨酸。這表明，與正常組織相比，PDA在體內(nèi)多胺合成中主要使用谷氨酸而非精氨酸（圖1）。

PDA的腫瘤微環(huán)境中精氨酸被耗竭
是什么原因?qū)е铝薖DA傾向于利用谷氨酸合成多胺？研究者分別從iKras^G12D和iKras^WT小鼠中分離出胰腺或腫瘤間質(zhì)液和血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明，血漿中的代謝物組成與是否患有腫瘤無關(guān)；且血漿代謝物含量與腫瘤間質(zhì)液（TIF）的代謝物含量不相關(guān)，在正常胰腺間質(zhì)液（NIF）和腫瘤間質(zhì)液（TIF）之間存在顯著差異。因此，與胰腺癌相關(guān)的代謝差異主要發(fā)生在TME（腫瘤微環(huán)境）內(nèi)，而非血漿中。且與血漿相比，對照組小鼠的NIF中精氨酸水平都較低，這表明它們被胰腺和/或其微環(huán)境所利用。然而，只有精氨酸及其尿素循環(huán)前體瓜氨酸在TIF中被進(jìn)一步耗竭，而谷氨酰胺的水平仍與血漿中的相似。最近發(fā)現(xiàn)，這種精氨酸的耗竭是由PDA的 TME中表達(dá)ARG1的骨髓細(xì)胞分解精氨酸所致，這進(jìn)一步促進(jìn)PDA細(xì)胞代償性地重新合成精氨酸。因此，KRAS驅(qū)動的PDA細(xì)胞能夠在完全沒有精氨酸或含有與TIF相當(dāng)水平的培養(yǎng)基中生存和增殖，盡管速度很慢。根據(jù)精氨酸在體內(nèi)的低可利用性，推測PDA重新調(diào)整其代謝，以有利于其獨特地使用谷氨酰胺進(jìn)行多胺合成�？傊�，PDA細(xì)胞對谷氨酰胺合成具有獨特使用性以適應(yīng)其精氨酸缺乏的微環(huán)境（圖1）。

圖1. PDA利用谷氨酰胺進(jìn)行DNS和多胺的合成

PDA依賴于DNS

盡管人類胰腺組織中調(diào)控鳥氨酸從頭合成（DNS）的OAT的mRNA水平在顯著低于其他組織，但與正常胰腺相比，在PDA腫瘤中的OAT的mRNA和蛋白水平均增加。鳥氨酸除了通過OAT從谷氨酰胺產(chǎn)生，或通過ARG從精氨酸產(chǎn)生之外，還可以通過肌酸合成途徑中的甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶（GATM）從精氨酸產(chǎn)生。

為了評估它們對多胺合成和腫瘤生長的不同貢獻(xiàn)，在AsPC-1細(xì)胞中分別敲除三種鳥氨酸合成酶，并與敲除多胺合成的限速酶ODC1進(jìn)行比較。選擇ARG2而不是ARG1是因為ARG1在PDA細(xì)胞中的表達(dá)水平無法檢測。結(jié)果顯示，與ODC1相似，當(dāng)敲除OAT而非ARG2或GATM后，才能抑制¹⁵N-Gln衍生的鳥氨酸和腐胺的合成。雖然敲除OAT后觀察到¹⁵N-Arg衍生的鳥氨酸增加，但總的鳥氨酸水平并沒有代償性增加，也未影響腐胺的水平，表明對DNS的抑制不會導(dǎo)致PDA中精氨酸衍生的鳥氨酸或多胺合成的代償性增加。相比之下，ODC1敲除導(dǎo)致其底物鳥氨酸的積累，并使OAT反應(yīng)向鳥氨酸降解逆轉(zhuǎn)；這又導(dǎo)致通過ARG2合成鳥氨酸（M+2）和尿素（M+2）以及通過GATM產(chǎn)生肌酸和肌酐（M+2）的¹⁵N-Arg衍生的合成代償性增加。隨后，¹⁵N-Arg衍生的鳥氨酸被引向谷氨酸（M+1）和脯氨酸（M+1）的合成。因此，盡管ODC1或OAT的敲除同樣抑制了多胺的合成，但敲除ODC1而非OAT可以代償性地誘導(dǎo)精氨酸介導(dǎo)的鳥氨酸合成。敲除OAT而非ARG2或GATM，在抑制AsPC-1細(xì)胞增殖方面與敲除ODC1一致；且補(bǔ)充腐胺后，該抑制作用得到逆轉(zhuǎn)，這表明，OAT是PDA細(xì)胞生長所必需的，而OAT介導(dǎo)的腐胺合成是生長維持的主要貢獻(xiàn)者。

在胰腺正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞中，敲除OAT抑制¹⁵N-Gln衍生的鳥氨酸和腐胺酸的低水平，同時誘導(dǎo)¹⁵N-Arg合成的代償性增加；這反過來又導(dǎo)致了鳥氨酸和腐胺酸總庫的增加，但不影響增殖。這些數(shù)據(jù)與PDA中敲除OAT的影響相反，在PDA中未觀察到精氨酸衍生的鳥氨酸或腐胺酸的顯著代償性增加，且PDA細(xì)胞增殖顯著減少，這揭示了OAT在胰腺癌細(xì)胞而非正常細(xì)胞中的關(guān)鍵作用以及其作為治療靶標(biāo)的潛力。

進(jìn)一步探究PDA中對DNS的體內(nèi)需求，監(jiān)測來自人類PDA細(xì)胞的正位異種移植的生長，其中OAT或ODC1被敲除。結(jié)果顯示，敲除OAT或ODC1抑制PDA的生長，在4周內(nèi)均顯著減小腫瘤大小。與體外結(jié)果一致，¹⁵N-Gln注入腫瘤小鼠體內(nèi)后，在移植的Oat基因敲除（KO）腫瘤中，¹⁵N標(biāo)記的鳥氨酸和腐胺水平都降低，表明DNS和多胺的合成都受到影響；但在Odc1基因敲除的腫瘤中，只有腐胺水平降低。總之，存在于TME中的多胺大多來自于PDA細(xì)胞，而不是非癌細(xì)胞，從而為通過抑制OAT來特異性和有效地靶向PDA提供治療窗口（圖2）。

圖2. OAT是PDA多胺合成和腫瘤生長的必要條件

KRAS驅(qū)動PDA的多胺合成
90%的胰腺癌中存在原癌基因KRAS突變，并促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展。而在非KRAS突變的胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3，其主要依賴于精氨酸用于多胺的合成，于是探究KRAS對DNS和多胺合成的調(diào)控作用。對多西環(huán)素誘導(dǎo)的iKras細(xì)胞系的分析表明，Kras^G12D抑制¹⁵N-Gln衍生的鳥氨酸和腐胺水平，而¹⁵N-Arg衍生的鳥氨酸和腐胺水平無影響，這導(dǎo)致總鳥氨酸和腐胺減少；通過¹⁵N-谷氨酸歸一化后依然如此，表明它的產(chǎn)生不是由于谷氨酸分解的增強(qiáng)。此外，Kras^G12D在小鼠PDA細(xì)胞或其在人類PDA細(xì)胞中的敲除導(dǎo)致OAT、ODC1以及精氨酸合成和精氨酸合成酶SRM和SMS的mRNA和蛋白水平均下降，但不影響ARG2。這一現(xiàn)象被KRAS效應(yīng)因子MEK的抑制劑（抑制劑AZD6244）所重現(xiàn)，而 PI3K（BKM120）、AKT（MK2206）或mTORC1（雷帕霉素）的抑制劑則不能重現(xiàn)，表明在PDA中KRAS-MEK軸調(diào)控鳥氨酸和多胺合成。

對PDA中所有四個關(guān)鍵的多胺合成基因（OAT、ODC1、SRM和SMS）共有的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)有六個在人類和小鼠之間保守的潛在候選基因位于OAT的轉(zhuǎn)錄起始位點附近：ZBTB14、SP1、KLF6、GTF2IRD1、CHURCH1和EGR1。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，沉默Klf6，但不沉默其他轉(zhuǎn)錄因子，顯著下調(diào)Oat、Odc1、Srm和Sms的表達(dá)，但不影響Arg2；且在Kras^G12D敲除后逆轉(zhuǎn)，表明KLF6是Kras^G12D的下游效應(yīng)器。且敲除KLF6后抑制谷氨酰胺衍生而非精氨酸衍生的鳥氨酸或腐胺水平。因此，KLF6是KRAS驅(qū)動的DNS和多胺合成的轉(zhuǎn)錄上調(diào)中的一個關(guān)鍵因子（圖3）。
 

圖3. KRAS促進(jìn)PDA中DNS和多胺的合成
 

抑制OAT可緩解PDA進(jìn)展
既然PDA依賴于OAT將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，并通過ODC1將鳥氨酸轉(zhuǎn)化為腐胺進(jìn)而變成多胺以促進(jìn)腫瘤生長，那么干預(yù)該代謝途徑是否可以緩解PDA進(jìn)展？研究者分別采用ODC1抑制劑（二氟甲基鳥嘌呤，DFMO）以及OAT抑制劑（5-氟甲基鳥嘌呤，5-FMO）進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，用5-FMO處理人或小鼠PDA細(xì)胞時，顯著抑制谷氨酸衍生的鳥氨酸和腐胺的合成，并有效地抑制PDA腫瘤細(xì)胞的增殖，且這一過程在乳腺癌細(xì)胞系中無法復(fù)現(xiàn)，表明5-FMO對胰腺癌細(xì)胞的特異性；而ODC1抑制劑DFMO的處理盡管表現(xiàn)出有效地抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果，但是其對非腫瘤細(xì)胞的抑制效果仍十分明顯，表明DFMO不加區(qū)分地影響癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞，存在潛在的毒性。

在體內(nèi)，用5-FMO處理引起iKras小鼠對PDA的顯著和劑量依賴性的抑制，這種影響伴隨著鳥氨酸和腐胺合成的幾乎完全被抑制，且身體未呈現(xiàn)消瘦及肝毒性。多胺類物質(zhì)可以改變TME中的免疫群體，誘發(fā)對抗腫瘤免疫的逃避，于是探究其對TME的影響。在正位iKras PDA腫瘤中敲除Oat或Odc1并不改變CD8⁺T細(xì)胞的比例，但導(dǎo)致了CD4⁺T細(xì)胞顯著增加。免疫抑制性粒細(xì)胞——骨髓源性抑制細(xì)胞的數(shù)量也有所減少，這與腫瘤較小及TME中多胺減少相一致。然而，這不太可能是多胺合成下降的主要抗腫瘤機(jī)制，因為在免疫缺陷小鼠中，人源腫瘤細(xì)胞中敲除OAT或ODC1仍能顯著降低小鼠的腫瘤負(fù)荷（圖4）。

OAT介導(dǎo)PDA的基因組及表觀遺傳改變
多胺可以影響轉(zhuǎn)錄、翻譯和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并從表觀調(diào)控免疫細(xì)胞的激活和功能。然而，多胺如何改變癌細(xì)胞，特別是PDA的表觀調(diào)控尚不清楚。對表達(dá)或敲除ODC1、OAT或ARG2的人類AsPC-1 PDA細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測，評估谷氨酸衍生的多胺與精氨酸衍生的多胺對PDA的轉(zhuǎn)錄改變的不同影響。結(jié)果顯示，敲除OAT或ODC1的細(xì)胞共有的差異表達(dá)基因的數(shù)量大約是敲除ARG2或ODC1的細(xì)胞的兩倍。聚類分析表明，ODC1敲除的差異表達(dá)基因與OAT敲除的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化的相似性高于ARG2敲除的細(xì)胞，后者與對照組更相似。ODC1是多胺合成的主要限速酶， OAT在為多胺合成提供鳥氨酸方面比ARG2有更大的貢獻(xiàn)，且OAT的抑制對多胺誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化有重大影響。

對PDA細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)座酶可接觸染色質(zhì)的高通量篩選（ATAC-seq）檢測，結(jié)果顯示，敲除ODC1后，染色質(zhì)可及性發(fā)生顯著的變化，重點關(guān)注敲除ODC1和OAT后持有一致的共同變化的最大的差異表達(dá)基因簇（簇I，561個基因和簇V，403個基因），發(fā)現(xiàn)敲除ODC1和OAT而非ARG2，mRNA水平降低與簇I中染色質(zhì)通路的減少一致；簇V中也是如此，這表明，OAT而非ARG2在多胺驅(qū)動的染色質(zhì)通路改變中的作用，這些改變對應(yīng)于基因表達(dá)的顯著變化。對敲除ODC1的PDA細(xì)胞中所有2698個差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因組富集分析（GSEA），確定了前18個下調(diào)通路，涉及122個與細(xì)胞增殖、分化、對生長因子的反應(yīng)、細(xì)胞因子和對饑餓的反應(yīng)有關(guān)的基因，與敲除OAT或ODC1后的腫瘤生長抑制一致；且在補(bǔ)充腐胺后，從該組中隨機(jī)選擇的樣本（7個基因）的表達(dá)得到恢復(fù)，進(jìn)一步支持了OAT而非ARG2在多胺驅(qū)動的與PDA生長有關(guān)的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)變化中的重要作用（圖4）。
 

圖4. 抑制OAT可緩解PDA并改變其轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳

小結(jié)
本研究在人類和小鼠的體外和體內(nèi)模型中使用利用¹⁵N谷氨酰胺同位素示蹤及代謝組、基因敲除和抑制劑等方法，表明PDA對谷氨酰胺衍生的鳥氨酸合成有顯著的依賴性。這一過程是通過OAT介導(dǎo)，它支持多胺的合成，是腫瘤生長所必需的。這種依賴性與PDA腫瘤微環(huán)境中的精氨酸耗竭有關(guān)，并且是由突變的KRAS驅(qū)動。激活的KRAS誘導(dǎo)OAT和多胺合成酶的表達(dá)，導(dǎo)致PDA腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳的改變。PDA組織（而非正常組織）對OAT介導(dǎo)的從頭合成鳥氨酸的獨特依賴性，為OAT抑制劑治療胰腺癌提供了一種具體而有效的策略，而且毒性最小。

參考文獻(xiàn)
Ornithine aminotransferase supports polyamine synthesis in pancreatic cancer. Nature. 2023.

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繪譜幫你測
本研究利用同位素示蹤及代謝組、基因敲除和抑制劑等方法，揭示胰腺癌細(xì)胞通過鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（OAT）促進(jìn)多胺合成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長的重要機(jī)制。其中¹⁵N谷氨酰胺等代謝流分析，常規(guī)靶向和非靶向代謝組，腐胺，精胺，亞精胺，精氨酸，鳥氨酸的絕對定量麥特繪譜均可檢測。本公司經(jīng)典的已獲得客戶高度肯定的Q300全定量檢測技術(shù)和升級的新品Q1000技術(shù)，均可精確捕捉到論文中提到的代謝途徑中所有小分子產(chǎn)物的細(xì)微改變。目前Q300技術(shù)已助力客戶在Science, Cell Metabolism, Gut, Advanced Science, Diabetes Care, Nature Communications, PNAS等權(quán)威期刊發(fā)表近60篇SCI文章，平均IF>10分。

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