腫瘤干細(xì)胞對(duì)腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用。從本質(zhì)上講，腫瘤干細(xì)胞通過自我更新和無限增殖維持著腫瘤細(xì)胞群的生命力。

一、腫瘤干細(xì)胞的特性

1、具有無限增殖和分化潛能

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)長(zhǎng)期的突變積累過程，在皮膚及腸黏膜上皮等腫瘤的高發(fā)部位，衰老細(xì)胞不斷地死去并脫離機(jī)體，只有干細(xì)胞是唯一可以長(zhǎng)期存在的細(xì)胞，有可能積累多次突變而生成腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)而最終形成腫瘤。

2、比例小

腫瘤干細(xì)胞主要通過兩種方式分裂：

一種是對(duì)稱分裂，即形成兩個(gè)相同的腫瘤干細(xì)胞或兩個(gè)相同的分化腫瘤細(xì)胞；

另一種是非對(duì)稱分裂，即腫瘤干細(xì)胞分裂后形成的兩個(gè)細(xì)胞中有一個(gè)細(xì)胞不可逆地走向分化的終端成為功能專一的分化腫瘤細(xì)胞，而另一個(gè)保持親代的特征，仍作為腫瘤干細(xì)胞保留下來。由于這種類似于干細(xì)胞的分裂方式，低密度的腫瘤干細(xì)胞能在維持自身數(shù)量的同時(shí)產(chǎn)生出分化的腫瘤細(xì)胞。

3. 具有高端粒酶活性

高活性的端粒酶可抑制細(xì)胞增殖過程中端粒長(zhǎng)度的縮短，延長(zhǎng)腫瘤干細(xì)胞的增殖壽命，這為腫瘤干細(xì)胞的不斷增殖和分化提供了基礎(chǔ)條件。

4. 抗凋亡家族蛋白過表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，大部分腫瘤干細(xì)胞中抗凋亡基因 Bcl- 2 的表達(dá)量顯著增加，從而啟動(dòng)腫瘤干細(xì)胞內(nèi)抗凋亡程序，阻斷 Bid 和 Bad 等促凋亡蛋白引起的線粒體凋亡途徑，并進(jìn)一步阻斷胱天蛋白酶凋亡途徑，防止腫瘤干細(xì)胞發(fā)生凋亡。

5. DNA 修復(fù)能力顯著增強(qiáng)

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞內(nèi)與 DNA 損傷修復(fù)相關(guān)的核酸內(nèi)切酶、DNA 聚合酶和 DNA 連接酶等酶蛋白的合成增加、活性增強(qiáng)，增強(qiáng)了腫瘤干細(xì)胞的抗 DNA 損傷能力，使得腫瘤干細(xì)胞可逃避以 DNA 損傷為主的腫瘤治療手段。

6. 長(zhǎng)時(shí)間處于 G0 期

臨床上普遍使用的化療藥物主要是針對(duì)增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，處在 G0 期的大多數(shù)腫瘤干細(xì)胞能逃避傳統(tǒng)腫瘤治療方法的殺傷，一旦時(shí)機(jī)成熟或停止用藥，它們便成為復(fù)發(fā)的根源。

7. 處于低氧環(huán)境中

腫瘤干細(xì)胞通常位于由發(fā)育良好的三維細(xì)胞外基質(zhì)包裹的低氧環(huán)境中，這些細(xì)胞外基質(zhì)起到很好的屏障作用，盡可能避免了腫瘤干細(xì)胞接觸到抗腫瘤藥物。同時(shí)由于射線引起的 DNA 損傷需要氧氣，所以腫瘤干細(xì)胞所處的低氧環(huán)境使得放療對(duì)腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用也非常局限舊。

8. 表達(dá)干細(xì)胞特異標(biāo)志物

這些特異性蛋白或標(biāo)志物在腫瘤干細(xì)胞的增殖、腫瘤干細(xì)胞分化成腫瘤組織周圍所必須的血管等組織、腫瘤干細(xì)胞的遷移等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。利用這些特異性的表面標(biāo)志物達(dá)到腫瘤干細(xì)胞分離或鑒定的目的。

二、腫瘤干細(xì)胞分離

1. 免疫磁珠分選（MACS）

MACS 是基于腫瘤干細(xì)胞表面特異性抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，之后在外部磁場(chǎng)的作用下，連接有單克隆抗體磁珠的腫瘤干細(xì)胞停留在磁場(chǎng)中，而無特異性表面抗原的腫瘤細(xì)胞則不能與免疫磁珠結(jié)合，因而不能在磁場(chǎng)中停留，從而得以分離出腫瘤干細(xì)胞。

2. 流式細(xì)胞分選（FACS）

FACS 是通過將待分選的腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞用同一種或多種熒光素標(biāo)記的特異性抗體標(biāo)記，根據(jù)腫瘤干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞結(jié)合熒光素標(biāo)記抗體能力的差異，通過流式細(xì)胞儀將腫瘤干細(xì)胞分選出來的方法。

3. 根據(jù)生物學(xué)特性分離

根據(jù)腫瘤干細(xì)胞具有的某些生物學(xué)特性將腫瘤干細(xì)胞分離篩選出的方法。如可以通過細(xì)胞核對(duì)核染料的拒染性質(zhì)、腫瘤干細(xì)胞體外培養(yǎng)所需的特殊條件等特性，分離出腫瘤干細(xì)胞。

4. 旁群細(xì)胞分選法 (SP)

腫瘤干細(xì)胞具有對(duì)核染料 Hoechst 33342 拒染的特性。Hoechst 33342 是一種核酸染料，在紫外光激發(fā)下可發(fā)出藍(lán)色熒光 (波長(zhǎng) 450 nm 左右) 和紅色熒光 (波長(zhǎng) 650 nm 左右)，腫瘤干細(xì)胞可將染料外排，而不發(fā)出熒光，從而可將這類旁群細(xì)胞分離出來。

5. 無血清培養(yǎng)基分選法 (SFM)

在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入特定的生 長(zhǎng)因子和細(xì)胞添加劑，使絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞由于缺乏生長(zhǎng)所必須的血清成分而停止生長(zhǎng)。

經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后最終死亡，而腫瘤干細(xì)胞則可以在含特定生長(zhǎng)因子和添加劑的無血清培養(yǎng)基中呈球狀懸浮生長(zhǎng)。

經(jīng)幾代的培養(yǎng)增殖形成富含腫瘤于細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞球在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入特定的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞添加劑，使絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞由于缺乏生長(zhǎng)所必須的血清成分而停止生長(zhǎng)。

經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后最終死亡，而腫瘤干細(xì)胞則可以在含特定生長(zhǎng)因子和添加劑的無血清培養(yǎng)基中呈球狀懸浮生長(zhǎng)，經(jīng)幾代的培養(yǎng)增殖形成富含腫瘤于細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞球。

6. 聯(lián)合多種方法分離

在目前的研究中，腫瘤干細(xì)胞的分離并不是采用單一的方法，而是選用兩種或者兩種以上的分離方法，以獲得數(shù)量更多、純度更高的腫瘤干細(xì)胞。

三、腫瘤干細(xì)胞鑒定

1. 利用腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定

目前，腫瘤干細(xì)胞最為廣泛且可靠的鑒定方法就是利用腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物。將分離出的腫瘤干細(xì)胞通過免疫組織化學(xué)法、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)等方法測(cè)定陽性或陰性細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況，進(jìn)而鑒定是否是腫瘤干細(xì)胞。

2.異種移植成瘤性實(shí)驗(yàn)鑒定

將分離出的腫瘤于細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液后種植到異種動(dòng)物體內(nèi)，如將人的腫瘤干細(xì)胞接種于 NOD/SCID 小鼠體內(nèi)，觀察其能否形成腫瘤病灶，且異種動(dòng)物體內(nèi)形成的腫瘤病灶在組織學(xué)結(jié)構(gòu)上與原發(fā)腫瘤病灶類似，則可鑒定為腫瘤干細(xì)胞。一般來說，腫瘤干細(xì)胞形成腫瘤病灶所需的細(xì)胞密度比普通腫瘤細(xì)胞要小。

3. 腫瘤干細(xì)胞的其他鑒定方法

對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的鑒定，還可通過腫瘤干細(xì)胞具有的類干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。

如根據(jù)腫瘤干細(xì)胞核對(duì)核染料拒染 (如 Hoechst 33342 染料) 的性質(zhì)進(jìn)行鑒定；

根據(jù)腫瘤干細(xì)胞長(zhǎng)期處于靜止?fàn)顟B(tài)的特性，應(yīng)用溴脫氧尿嘧啶核苷法進(jìn)行鑒定和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)鑒定等。

四、細(xì)胞成瘤性質(zhì)控-端粒酶活性檢測(cè)方法

端粒酶催化亞基TERE表達(dá)量檢測(cè)試劑盒（QPCR法）

產(chǎn)品說明：端粒酶 (Telomerase ) 是一種酶促核糖核蛋白復(fù)合物。其催化亞基 (TERT) 具有逆轉(zhuǎn)錄酶的特性，TERT被認(rèn)為是端粒酶活性表達(dá)的關(guān)鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致，與端粒酶的活化程度密切相關(guān)。因此，對(duì)端粒酶催化亞基的檢測(cè)可以間接反映樣本中端粒酶活性。

本產(chǎn)品試劑盒采用雙色熒光qPCR (TaqMan探針法) 檢測(cè)端粒酶催化亞基TERT基因和內(nèi)參基因GAPDH 。通過提取細(xì)胞RNA ，利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 以cDNA為模板在單管中利用多重?zé)晒舛�量PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng) (雙重探針：FAM 、Cy5) 。選用293T細(xì)胞為陽性對(duì)照以及MRC-5細(xì)胞為陰性對(duì)照，判斷樣本中是否有TERT基因表達(dá)。該試劑盒具有以下特點(diǎn)：

1. 靈敏：雙色探針，靈敏度高。

2. 穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。

3. 可靠：含內(nèi)參基因，避免假陰性。

4. 方便：操作簡(jiǎn)單，無需電泳步驟。

5. 定量： 以CT值判斷，可定量檢測(cè)。