腫瘤的發(fā)展除了與癌細胞自身基因突變導(dǎo)致的惡性增殖有關(guān)以外，還與腫瘤微環(huán)境息息相關(guān)。在癌癥中，正常組織中和諧的細胞相互作用關(guān)系被破壞，原本保護正常細胞生存的微環(huán)境在腫瘤細胞的影響下，逐漸演變成適應(yīng)腫瘤生長的條件。針對腫瘤微環(huán)境的檢測和表征研究也可為癌癥治療提供新的思路。
 
目前空間多組學(xué)技術(shù)已用于研究幾種類型癌癥中腫瘤免疫微環(huán)境的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組，從這些方法獲得的數(shù)據(jù)已與免疫組化和多參數(shù)分析相結(jié)合，以產(chǎn)生癌癥進展的標(biāo)記物。傳統(tǒng)分析技術(shù)受樣品空間分辨率以及分析靈敏度的限制，無法精準(zhǔn)獲取靶向部位，而對其中特異代謝物的差異表征就更加困難。組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)等的發(fā)展而得到廣泛的應(yīng)用，而激光顯微切割 (LMD, laser microdissection) 技術(shù)可以方便地對特定的組織區(qū)域的精確分離（圖2）。結(jié)合高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)，基于ZenoTOF^® 7600 系統(tǒng)，將空間定位準(zhǔn)確的微區(qū)細胞代謝譜進行全面準(zhǔn)確的表征。代謝譜是免疫微環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子，可能通過影響癌細胞的增殖潛能和適應(yīng)環(huán)境而發(fā)揮作用。代謝特征的異質(zhì)性似乎有助于腫瘤免疫微環(huán)境的異質(zhì)性。
   
腫瘤微區(qū)樣品制備
 
由制備好的腫瘤組織切片樣本置于激光顯微切割載物臺，確定好焦距平面后，將視野移動到待切割的細胞區(qū)域（先通過H&E染色的平行樣本確定腫瘤組織分區(qū)），在調(diào)節(jié)好相關(guān)參數(shù)后開始進行切割。通過對樣本分別進行水溶性代謝物和脂溶性代謝物的提取，進而進行基于液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的全面的代謝組學(xué)分析。
 

 
圖2. 組織切片樣本用于激光顯微切割分離體制備。經(jīng)過蘇木精-伊紅（HE）染色確定組織切片中不同類型的細胞區(qū)域（左）包括原位癌、浸潤癌和癌旁細胞，在平行的未染色組織切片中的相應(yīng)位置進行激光顯微切割獲得分離體（右）。
 
代謝物全面表征
 
組織細胞中代謝物成分復(fù)雜多樣，且有較多同分異構(gòu)體，僅有準(zhǔn)確的高分辨一級無法對化合物進行確證。針對大量樣本，SCIEX OS軟件可自動進行峰提取和搜庫，通過一級質(zhì)量數(shù)、同位素豐度和二級碎片的匹配對樣本中的代謝物進行鑒別（圖3），使篩查流程快速準(zhǔn)確。在代謝組學(xué)的樣本中共鑒定173個化合物，包括氨基酸類、核苷類、吲哚類、脂肪酸類等。
 

 
圖3. 代謝物鑒定界面示例。以樣本中鑒定到的脯氨酸（Proline）為例，Proline分子式為C₅H₉NO₂，檢測到的MS信號與理論質(zhì)荷比相比，質(zhì)量數(shù)偏差為-0.3ppm，同位素豐度比與理論值偏差為1.3%，MSMS與代謝物庫中Proline的標(biāo)準(zhǔn)譜圖匹配度為100，以此可判定鑒定到的信號為Proline。
 
在脂質(zhì)組學(xué)分析樣本中共鑒定到550個脂質(zhì)化合物，基于ZenoTOF^® 7600 系統(tǒng)特有的電子活化解離（EAD）碎裂模式，可以鑒定出其中一些脂質(zhì)化合物的精細結(jié)構(gòu)，如脂肪酸鏈連接的具體位置（sn1或sn2）以及連接的不飽和脂肪酸雙鍵的具體位置（圖4）；對于樣本中檢測到的脂質(zhì)化合物包括固醇酯類、神經(jīng)酰胺類、溶血磷脂膽堿類、磷脂膽堿類、溶血磷脂乙醇胺類、磷脂乙醇胺類、磷脂肌醇類、磷脂絲氨酸類、鞘酯類、甘油二酯類、甘油三酯類。
 

 
圖4. 脂質(zhì)化合物精細結(jié)構(gòu)鑒定示例。以甘油三酯TG (18:1/18:1/18:1)為例，在EAD碎裂模式下，化合物[M+Na]+峰可以產(chǎn)生特征的碎片離子，幫助解析甘油三個羥基各自所連接的脂肪酸組成，以及在高質(zhì)荷比區(qū)域產(chǎn)生的連續(xù)CH2斷裂碎片確定不飽和鍵的位置（C9和C10間為雙鍵）。
 
差異代謝物分析
 
在質(zhì)控樣本（quality control, QC, 所有樣本等體積混合，整個分析批次中每6個樣本穿插一針QC樣本進樣）中，化合物峰面積RSD%不超過30%（n=8），在代謝組學(xué)樣本中共檢出100個代謝物，脂質(zhì)組學(xué)樣本中共檢出502個代謝物，并將這些化合物在所有的樣本包括原位癌組織、浸潤癌組織、癌旁組織進行峰面積提取。
 
將獲得的各種組織中化合物含量信息進行生物統(tǒng)計學(xué)分析，以浸潤癌組織v.s.癌旁組織為例，共找到84個差異代謝物（圖5）。經(jīng)過后續(xù)進一步生物學(xué)驗證，確定的差異代謝物可以幫助開展癌細胞在空間定位及異質(zhì)性的精準(zhǔn)區(qū)分工作，更好的理解例如腫瘤轉(zhuǎn)移的起源和發(fā)展、侵襲能力、對藥物的敏感性等方面的特點，從而制定個體化的精準(zhǔn)治療方案。
 

 
圖5. 浸潤癌組織v.s.癌旁組織中的差異代謝物熱圖。通過統(tǒng)計學(xué)分析，包括t-test的p值小于0.05以及PLSDA計算的VIP值不小于1作為篩選條件，獲得了84個差異代謝物。
 
總結(jié)
 
通過對組織切片進行激光顯微切割獲取空間定位準(zhǔn)確的微量樣本，并與SCIEX ZenoTOF^® 7600 系統(tǒng)相結(jié)合，實現(xiàn)微量細胞水溶性和脂溶性代謝物的全面表征以及高靈敏度組學(xué)分析。可將此方案應(yīng)用于其他組織切片樣本，助力空間多組學(xué)研究的開展。
 
致謝：
感謝廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林樹海教授及其課題組成員華錚翼、姚博對方案中組織切片和樣本制備的支持；
感謝丹納赫生命科學(xué)平臺徠卡顯微系統(tǒng)公司高天龍、連其林對顯微切割技術(shù)的支持。
 
空間多組學(xué)研究質(zhì)譜平臺：
多重碎裂高分辨質(zhì)譜
SCIEX ZenoTOF^® 7600 系統(tǒng)：

 
ZenoTOF^® 7600 系統(tǒng)于2021年推出即獲得國際“分析科學(xué)家創(chuàng)新獎”之首，集成了多項前沿新技術(shù)，包括：
 
能實現(xiàn)更高二級質(zhì)譜靈敏度的Zeno^™ Trap (Zeno 阱) 技術(shù)；
能與經(jīng)典CID碎裂技術(shù)互補的電子活化解離 (EAD) 技術(shù)；
升級的133Hz超快速二級質(zhì)譜掃描能力；
新一代全景質(zhì)譜Zeno SWATH^® DIA數(shù)據(jù)依賴型采集技術(shù)等。
 
多重碎裂質(zhì)譜ZenoTOF^® 7600 系統(tǒng)的卓越性能，極大提升生命科學(xué)多組學(xué)研究的深度和廣度，尤其在高通量高深度蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾（尤其是糖蛋白質(zhì)組學(xué)）、全景非靶向代謝組學(xué)、脂質(zhì)精細結(jié)構(gòu)解析等尖端領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。