視網(wǎng)膜母細胞瘤（RB）是一種兒童眼內(nèi)腫瘤，如果不治療，會導致完全失明，并在晚期嚴重時死亡，近年來科學家通過開發(fā)針對RB細胞的靶向治療來拯救患兒的視力和生命。視網(wǎng)膜主要由甘油磷脂組成，進一步可分類為磷脂（PE）和磷脂酰膽堿（PC）。用質(zhì)譜成像技術（DESI MS）進行脂質(zhì)成像檢測是精確測量組織代謝產(chǎn)物和研究正常和癌變組織之間脂質(zhì)變化的強有力的手段之一。基于DESI MS的脂質(zhì)成像有助于視網(wǎng)膜疾病的研究，本篇文章主要以視網(wǎng)膜母細胞瘤（RB）作為研究對象，通過DESI-MS和免疫組學等技術，更深入地探究了NCL-APT核糖核酸酶適體對RB的調(diào)節(jié)治療作用。
 

Kamalnayan Bajaj視力和眼科研究的Subramanian Krishnakumar教授在Molecular Therapy—Nucleic Acids發(fā)表的題為 “Nucleolin-aptamer therapy in retinoblastoma: molecular changes and mass spectrometry–based imaging ”（IF：11.454）的研究成果，通過DESI-MS成像技術、流式細胞術、qPCR、免疫組織化學、免疫印跡分析等技術，發(fā)現(xiàn)了核仁適體(NCL-APT)治療RB特征，探究了NCL-APT調(diào)節(jié)RB機理，描繪了NCL-APT的DESI-MS脂質(zhì)成像圖譜，為NCL-APT的RB靶向治療提供了理論依據(jù)。
 

1. RB中NCL的表達和NCL-APT的攝取

通過qPCR、免疫組織化學、流式細胞術和免疫印跡分析RB腫瘤樣本的NCL，發(fā)現(xiàn)RB細胞系Y79和WERI-Rb1和RB腫瘤細胞質(zhì)中的NCL均顯著上調(diào)。RB腫瘤細胞質(zhì)和細胞表面的NCL水平升高，可有助于攝取RB腫瘤細胞中的NCL-APT。NCL-APT周期變化中，WERI-Rb1的G0-G1期增加，Y79的S期停滯。表明NCL在RB細胞和細胞系中差異表達，NCL-APT產(chǎn)生周期性變化（圖1）。

 

圖1 核仁素在RB腫瘤樣本和細胞系中的表達

 

2. NCL-APT調(diào)節(jié)RB中的致癌miRNA

作者研究NCL-APT對RB的miRNA表達影響。通過微陣列分析，顯示miRNA顯著下調(diào)。NCL-APT處理后miRNA仍下調(diào)，qPCR在WERI-Rb1細胞中作用顯著。說明miRNA譜中其他下調(diào)的miRNA表達變化也得到了驗證（圖2）。

 

 圖2 NCL-APT對miRNA表達的影響

 

3. NCL-APT在體外和體內(nèi)干擾RB：對miRNA、凋亡蛋白的影響

作者采用MTT研究RB、MIO-M1細胞系中NCL-APT生長和增殖。但細胞分裂的抑制導致細胞毒性，使RB細胞系的生存能力降低。通過RB和MIO-M1細胞系的細胞活力測試，證實了NCL-APT活性的特異性（圖3）。

 

圖3 NCL-APT對細胞增殖的影響

 

NCL-APT和LNA-NCL-APT在Y79異種移植小鼠的腫瘤部位附近皮下（皮下）治療，顯示腫瘤生長減少。說明不同治療中切除的腫瘤大小差異明顯（圖4）。

 

 

圖4 NCL-APT和LNA-NCL-APT的Y79異種移植物模型

 

采用微陣列觀察NCL-APT處理的miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA在異種移植的腫瘤組織中被下調(diào)。表明NCL-APT對miRNA的影響導致腫瘤發(fā)生變化。實驗通過正常裸鼠血清miRNA與Y79異種移植小鼠血清相比，顯示miR-18a和miR-19b-1表達水平升高。NCL-APT皮下注射和LNA-NCL-APT腹腔注射組比較發(fā)現(xiàn)，所有治療組中miR-18a表達受影響程度相似。免疫印跡分析顯示，不同模式下FOXM1表達不同，但表達均下調(diào)。說明體外和體內(nèi)NCL-APT治療對RB生長的抑制是由mRNA、致癌miRNA和凋亡標志物進行整合調(diào)節(jié)介導的（圖5）。

 

圖5 Y79異種移植物上NCL-APT和

LNA-NCL-APT治療后的分子變化

 

4. LNA-NCL-APT介導的凋亡標志物變化和細胞因子水平：整合體分析

LNA-NCL-APT處理的異種移植物中腫瘤凋亡蛋白和細胞因子發(fā)生變化。蛋白質(zhì)陣列用PBS和LNA-NCL-APT處理的腫瘤組織研究凋亡標記物，顯示外源性和內(nèi)源性途徑介質(zhì)的顯著差異。LNA-NCL-APT治療中，趨化細胞因子和促有絲分裂細胞因子混合表達。LNA-NCL-APT腹腔注射治療組織的IHC研究也顯示細胞核PCNA表達水平下降。綜合網(wǎng)絡建模和分析，揭示了關鍵途徑、基因等在NCL-APT治療過程中的變化（圖5）。

 

5. 異種移植組織的脂質(zhì)譜分析

通過MS/MS和數(shù)據(jù)庫檢索，在DESI  MS中不同RB細胞系中觀察到的高強度峰，與未處理組相比有顯著差異（圖6）。NCL-APT和LNA-NCL-APT治療Y79異種移植物，分析皮下注射和腹腔注射的脂質(zhì)質(zhì)譜。腫瘤切片分析顯示NCL-APT皮下注射的脂質(zhì)強度降低，少數(shù)組織區(qū)域變化不明顯（圖7）。說明脂質(zhì)水平的變化與適體有關，因為脂質(zhì)合成的抑制或水平的降低直接影響細胞增殖。

圖6 RB細胞系DESI MS成像

   

圖7 NCL-APT和LNA-NCL-APT體內(nèi)評估后PC水平的變化

通過免疫組學、質(zhì)譜成像（DESI-MS）等技術，探究NCL-APT對視網(wǎng)膜母細胞瘤（RB）的表達和治療。通過體外、體內(nèi)NCL-APT對RB的影響，說明通過調(diào)節(jié)mRNA、致癌miRNA和凋亡標志物可抑制RB生長。脂質(zhì)合成的抑制或水平的降低也直接影響RB的細胞增殖。同時，也進一步證實了NCL-APT治療RB的有效性，也為RB的靶向治療提供新思路。

 

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