書接上回，上周跟大家分享了基于Flex技術(shù)的FFPE樣本單細(xì)胞RNA測(cè)序解決方案，其中提到了M20技術(shù)也可以對(duì)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。那M20技術(shù)有什么特點(diǎn)呢？M20技術(shù)和Flex技術(shù)比較又各有什么特點(diǎn)呢？下面我們一一道來(lái)。首先我們會(huì)介紹M20技術(shù)原理，技術(shù)特點(diǎn)，實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量表現(xiàn)，以及M20文章案例，然后對(duì)兩種技術(shù)進(jìn)行比較與總結(jié)，希望能夠幫助大家更好的選擇適合自己研究的技術(shù)平臺(tái)。
 

M20技術(shù)原理及工作流程

M20技術(shù)基于隨機(jī)引物擴(kuò)增原理，可實(shí)現(xiàn)全樣本類型、全物種、全長(zhǎng)RNA的高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先將樣本制備成單細(xì)胞或單細(xì)胞核懸液，對(duì)FFPE樣本就是分離單細(xì)胞核之后進(jìn)行核膜的透化，使得隨機(jī)引物以及試劑進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，然后隨機(jī)引物在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行原位逆轉(zhuǎn)錄以捕獲全轉(zhuǎn)錄組的全長(zhǎng)信息，并在cDNA一鏈末端加上捕獲接頭。最后單個(gè)細(xì)胞核中的cDNA在微液滴平臺(tái)或者微孔平臺(tái)上完成細(xì)胞標(biāo)記，隨后進(jìn)行擴(kuò)增和二代測(cè)序。
 

圖 M20 seq技術(shù)路線

M20 seq技術(shù)優(yōu)勢(shì)

▪ 全樣本類型：不僅可用于新鮮組織、凍存組織，還可以完美解決FFPE樣本難以進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的難題。
▪ 全長(zhǎng)序列轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：單細(xì)胞全長(zhǎng)RNA測(cè)序可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因突變、基因融合、拷貝數(shù)變異、可變剪接等基因結(jié)構(gòu)的研究。
▪ 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：不同于10x的3’RNA捕獲和探針捕獲原理，基于隨機(jī)引物的M20技術(shù)同時(shí)可檢測(cè)到mRNA和非編碼RNA（主要是lncRNA）。實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平對(duì)lncRNA進(jìn)行研究的技術(shù)突破。
▪ 跨平臺(tái)兼容性：在微液滴（如10x）與微孔技術(shù)（如BD）平臺(tái)均能獲得優(yōu)異的檢測(cè)效果。
▪ 全物種：無(wú)論是細(xì)菌等原核生物細(xì)胞，還是人類、動(dòng)物、植物等真核生物細(xì)胞，都可以通過(guò)M20 Seq進(jìn)行測(cè)序。
▪ 超高通量：細(xì)胞捕獲數(shù)大幅提高，最高可達(dá)到百萬(wàn)級(jí)，是現(xiàn)有單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)通量的百倍以上。
 

圖M20 seq技術(shù)優(yōu)勢(shì)
 

M20技術(shù)對(duì)FFPE樣本進(jìn)行實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)展示

下面為大家展示基于M20技術(shù)對(duì)FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量。首先看一下M20 Genomics官方公布的多種人的FFPE組織樣本（如肺癌、肝癌、乳腺癌等）的測(cè)試數(shù)據(jù)，從數(shù)據(jù)結(jié)果來(lái)看，測(cè)序數(shù)據(jù)量在100G左右的時(shí)候可檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)均能達(dá)到5000+，單個(gè)細(xì)胞中位基因數(shù)在800-1400之間�？粗�這樣的FFPE樣本測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果還是很可喜的！
 

嚴(yán)謹(jǐn)如我，伯豪同樣用FFPE樣本對(duì)M20技術(shù)進(jìn)行了多次測(cè)試評(píng)估。這里我們對(duì)一例前列腺癌樣本同時(shí)進(jìn)行了M20和Flex兩種技術(shù)檢測(cè)的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行展示，在同一樣本相同數(shù)據(jù)量的情況下縱向比較兩種技術(shù)對(duì)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)情況。

（1）FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序基本信息統(tǒng)計(jì)

測(cè)序基本信息統(tǒng)計(jì)中我們重點(diǎn)來(lái)看細(xì)胞數(shù)、中位基因數(shù)和檢測(cè)到的總基因數(shù)這三個(gè)重要指標(biāo)。在相同數(shù)據(jù)量的情況下，實(shí)測(cè)細(xì)胞數(shù)是M20 seq檢測(cè)到的更多（11067>9865），每個(gè)細(xì)胞的中位基因數(shù)檢出是10x Flex略顯優(yōu)勢(shì)（1243>1002），在基因總數(shù)檢出方面是M20 seq具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)（35757>16427）。

（2）FFPE樣本細(xì)胞群鑒定結(jié)果
在細(xì)胞群聚類和注釋這一步，通過(guò)singleR自動(dòng)注釋，M20的數(shù)據(jù)僅使用mRNA的高可變基因進(jìn)行細(xì)胞注釋的結(jié)果與Flex數(shù)據(jù)結(jié)果一致，鑒定出相同的細(xì)胞類群。
 

圖 僅用mRNA數(shù)據(jù)的M20 seq與10x Flex的SingleR注釋結(jié)果
 

這里需要強(qiáng)調(diào)的是基于隨機(jī)引物擴(kuò)增原理的M20 seq不僅能夠檢測(cè)到mRNA，還能檢測(cè)到非編碼RNA（包括lncRNA，miRNA等，主要檢測(cè)到的是lncRNA）,而基于探針捕獲原理的Flex技術(shù)目前只能檢測(cè)mRNA的表達(dá)信息。我們進(jìn)一步利用M20 seq中的mRNA以及lncRNA數(shù)據(jù)共同進(jìn)行降維聚類，SingleR注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)比10x Flex增加了中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞群。

看到這個(gè)結(jié)果不知大家是否有疑問(wèn)：同一樣本，為什么增加了lncRNA信息之后細(xì)胞群注釋“憑空”多出了兩種細(xì)胞類群呢？嚴(yán)謹(jǐn)如我，小編用經(jīng)典marker基因進(jìn)行人工注釋確實(shí)驗(yàn)證了這個(gè)樣本是有中性粒細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞存在的。這證明了增加lncRNA可提升細(xì)胞聚類注釋效果，提高單細(xì)胞數(shù)據(jù)的細(xì)胞群鑒定分辨率，有可能發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞亞群。
 

圖 M20 Seq基于mRNA以及非編碼RNA進(jìn)行降維聚類、SingleR注釋

（3）lncRNA占比分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)
以往的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組能夠檢測(cè)到的lncRNA很少，因此目前單細(xì)胞水平的lncRNA研究有較大空白。從上述的細(xì)胞注釋結(jié)果能夠看出增加lncRNA的單細(xì)胞數(shù)據(jù)可能提供更多的生物學(xué)信息。那M20 技術(shù)能夠檢測(cè)到多少lncRNA呢？從M20 Seq檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看到，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的lncRNA占比在6%-30%。從這個(gè)結(jié)果小編看到了單細(xì)胞中具有重要生物學(xué)意義的lncRNA在向我們招手！
 

M20技術(shù)對(duì)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞核測(cè)序的文章案例

下面跟大家分享一篇M20 Genomics團(tuán)隊(duì)近期在NC期刊發(fā)表的M20 Seq技術(shù)對(duì)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞核測(cè)序的文章。
 

文章標(biāo)題：High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq
發(fā)表期刊：Nature Communications
發(fā)表時(shí)間：2023年5月
文章摘要：該研究介紹了通過(guò)隨機(jī)引物捕獲全長(zhǎng)總RNA，用于FFPE組織的單細(xì)胞核測(cè)序新技術(shù)——SnRandom-seq（也就是M20 seq）。文章首先展示了SnRandom-seq對(duì)FFPE小鼠組織和FFPE人肝癌樣本進(jìn)行單細(xì)胞核測(cè)序（SnRNA-seq）的結(jié)果，說(shuō)明SnRandom-seq技術(shù)可為臨床FFPE樣本提供一個(gè)強(qiáng)大的SnRNA-seq平臺(tái)。然后從相同的小鼠組織中收集FFPE和新鮮樣本，通過(guò)SnRandom-seq發(fā)現(xiàn)它們的RNA表達(dá)具有很高的相關(guān)性。最后文章還對(duì)SnRandom-seq與其他兩種FFPE snRNA-seq方法進(jìn)行了比較，重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了SnRandom-seq對(duì)lncRNA的檢出優(yōu)勢(shì)，以及snRandom-seq可以捕獲FFPE組織中更多的RNA，且基因覆蓋度更高。
 

圖 snRandon-seq與其他兩種FFPE snRNA-seq方法的比較

小編以為，文章中還有一個(gè)亮點(diǎn)值得拎取出來(lái)展示。那就是snRandom-seq在FFPE樣本中可以同時(shí)檢測(cè)到外顯子和內(nèi)含子序列，可以用于區(qū)分新轉(zhuǎn)錄的RNA（未剪接）和成熟的RNA（未剪接），因此更適合于RNA速率分析。再結(jié)合細(xì)胞周期分析，就能更好地探究細(xì)胞分化軌跡。
 

圖 基于snRandom-seq數(shù)據(jù)分析FFPE小鼠睪丸組織的細(xì)胞分化軌跡及細(xì)胞周期狀態(tài)

首先，F(xiàn)FPE樣本的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)和兩種技術(shù)的案例文章足以證明M20技術(shù)和Flex技術(shù)都實(shí)現(xiàn)了對(duì)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序的技術(shù)突破。那問(wèn)題就來(lái)了：哪種技術(shù)更好？應(yīng)該怎么選呢？下面小編就來(lái)進(jìn)行兩種技術(shù)特點(diǎn)的總結(jié)與比較，希望能夠解決大家的困擾。

基于技術(shù)原理的不同，M20技術(shù)（隨機(jī)引物進(jìn)行原理逆轉(zhuǎn)錄原理）和Flex技術(shù)（探針雜交捕獲原理）進(jìn)行FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序各有特色：
（1）在樣本類型方面：兩種技術(shù)都能夠?qū)�FFPE樣本，凍存樣本，新鮮組織樣本等多種類型的樣本進(jìn)行檢測(cè)。這里再次強(qiáng)調(diào)對(duì)FFPE樣本單細(xì)胞測(cè)序技能的解鎖，簡(jiǎn)直就是打開了臨床病理樣本資源庫(kù)，應(yīng)用前景不可限量。
（2）在物種適用方面：Flex技術(shù)目前僅適用于人和小鼠，M20技術(shù)沒(méi)有物種限制，人、動(dòng)植物及微生物均適用。就FFPE樣本而言，適用于人和小鼠兩個(gè)物種其實(shí)基本已經(jīng)滿足大家研究需要了。
（3）在測(cè)序數(shù)據(jù)方面：就目前我們實(shí)測(cè)的FFPE樣本數(shù)據(jù)來(lái)看，F(xiàn)lex技術(shù)檢測(cè)到的中位基因數(shù)略占優(yōu)勢(shì)，而在檢測(cè)到的基因總數(shù)上M20技術(shù)是占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的（Flex檢測(cè)基因總數(shù)最高18000，M20 檢出的基因總數(shù)可達(dá)30000-40000）。
（4）在數(shù)據(jù)挖掘方面：Flex技術(shù)只能檢測(cè)到FFPE樣本中的mRNA表達(dá)信息，而M20技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)到mRNA和非編碼RNA表達(dá)特征。所以M20技術(shù)在單細(xì)胞水平挖掘有重要生物學(xué)含義的非編碼RNA這一研究方向具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

相較于一決高下，我們更期待看到的是百花齊放，百家爭(zhēng)鳴的局面。所幸事實(shí)如此，M20和Flex技術(shù)總結(jié)比較下來(lái)，確實(shí)很難評(píng)出優(yōu)劣。據(jù)此，伯豪生物同時(shí)引進(jìn)M20和Flex兩種技術(shù)，希望能夠?yàn)榇蠹姨峁└鼜V泛的科研服務(wù)。那想要對(duì)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，這兩種技術(shù)該如何選擇呢？在此給出一些具體建議供大家參考：

（1）看重測(cè)序數(shù)據(jù)中的中位基因數(shù)這一指標(biāo)，從當(dāng)前樣本來(lái)看，10x Flex檢測(cè)出的中位基因數(shù)更具優(yōu)勢(shì)。一方面在原理上是因?yàn)榛�因特異性探針的靈敏度和特異性更高，更加容易覆蓋中低豐度基因；另一方面M20在當(dāng)前數(shù)據(jù)量下的細(xì)胞數(shù)略多，加大測(cè)序深度可能會(huì)增加中位基因數(shù)。我們可以期待后面更多的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)比；
（2）看重測(cè)序數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的基因總數(shù)，或者想挖掘新基因，建議選擇M20 seq；
（3）想要同時(shí)對(duì)FFPE樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，建議選擇10x Flex單細(xì)胞RNA測(cè)序和Visium FFPE空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。兩種技術(shù)用到是同一套探針，所以兩種數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析相關(guān)性會(huì)更高；
（4）想要在單細(xì)胞水平關(guān)注非編碼RNA，特別是lncRNA的表達(dá)信息，挖掘FFPE樣本中重要的lncRNA生物標(biāo)志物，建議選擇M20 seq；
（5）更個(gè)性化的想法與需求就需要我們共同溝通探討選擇更優(yōu)方案。