福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded，FFPE）樣本是臨床上長期保存病理樣本的常用方法，其可以和有價值的臨床數(shù)據(jù)（如患者臨床資料，患者生存預后信息，用藥和治療療效等）相關聯(lián)，為確定疾病的發(fā)生發(fā)展機制研究、生物標記物和藥物靶標提供了巨大的資源 ，是進行回顧性研究的不二之選。但這種FFPE處理方式會使組織中的核酸發(fā)生不同程度的降解，在過去由于技術受限使FFPE樣本無法最大程度發(fā)揮自身的價值，

單細胞技術的應用價值及火熱程度已無需贅述，然而目前市場上絕大部分高通量單細胞測序平臺對待測樣本的細胞活性要求較高。以往的技術難以在RNA降解嚴重的FFPE樣本中獲得好的檢測結(jié)果。

值得歡慶的是，陸續(xù)有公司實現(xiàn)了技術突破，并提供了對FFPE樣本進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的全新解決方案，其中10x Genomics推出的Flex技術和躍真生物（M20 Genomics）推出的M20技術非常具有代表性。
 

伯豪生物始終緊跟技術前沿，目前已針對這兩個新技術進行了全面調(diào)研，并通過對FFPE樣本單細胞測序進行多次測試與評估。接下來我們會根據(jù)調(diào)研及測評結(jié)果分別從技術原理，技術特點，尤其是測序數(shù)據(jù)質(zhì)量等方面對這兩個技術進行全面介紹。

Flex技術原理及工作流程
單細胞基因表達Flex技術通過探針雜交的方式捕獲靶基因，可捕獲到降解的RNA，再進行細胞捕獲建庫測序。針對 FFPE切片，首先將樣本制備成單細胞懸浮液，進而抽核得到細胞核樣本；然后采用靶向基因的探針對雜交目標RNA分子后連接的原理，進而完成文庫構(gòu)建。該方法能夠?qū)θ嘶蛐∈蟮腇FPE樣本進行單細胞RNA測序，可以用來分析數(shù)千個至數(shù)萬個細胞核的基因表達。
 

圖 單細胞基因表達Flex技術原理

Flex技術優(yōu)勢

▪ 擴大了樣本范圍：能對FFPE細胞和組織，以及PFA固定樣本進行單細胞測序分析，而不再受限于是否有新鮮組織可用，可以解鎖大量儲存在醫(yī)院以及生物樣本庫中的 FFPE 樣本的寶貴信息。

▪ 簡化了工作流程：FFPE樣本比較容易獲取，易運輸，并且樣本收集相對經(jīng)濟成本低。使樣本采集更加靈活，實驗時間安排更加方便。

▪ 提升了低表達基因檢測靈敏度：根據(jù)Flex和3’轉(zhuǎn)錄組的實測對比數(shù)據(jù)結(jié)果，在多種樣本類型中，相同的測序數(shù)據(jù)量下，F(xiàn)lex所得的測序數(shù)據(jù)飽和度更高，探針靈敏度更強，單個細胞內(nèi)可以檢測到的基因數(shù)更多。

▪ 與10x Visium CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組更配：Flex技術與10x同期推出的Visium CytAssist技術完美結(jié)合，能夠通過同一套探針對同一FFPE樣本進行單細胞轉(zhuǎn)錄組與空間轉(zhuǎn)錄組研究，基因表達一致性更高，數(shù)據(jù)聯(lián)合分析匹配性更好。
 

FFPE樣本單細胞測序?qū)崪y數(shù)據(jù)展示

下面來到大家最關心的環(huán)節(jié)：FFPE樣本單細胞測序數(shù)據(jù)質(zhì)量表現(xiàn)如何？10x官方測試了多種人的FFPE組織樣本（如乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌等等），測試結(jié)果顯示不同組織類型的FFPE樣本，其檢測到的基因中位數(shù)在400-1500之間。嚴謹如我，伯豪當然要對這一官方數(shù)據(jù)進行測試評估的。

目前伯豪已基于Flex技術對FFPE樣本單細胞測序進行多次測試。下面我們就用真實的數(shù)據(jù)說可靠的結(jié)論！以下為大家展示用Flex技術對兩個前列腺癌FFPE樣本檢測的結(jié)果。

（1）FFPE樣本單細胞測序基本信息統(tǒng)計

單細胞測序基本信息統(tǒng)計中我們比較關注的兩個指標是細胞數(shù)和中位基因數(shù)。從測序結(jié)果來看，兩個前列腺癌FFPE樣本測到的細胞數(shù)分別為9865，25231（上機細胞數(shù)分別為2萬和5萬個，即達到了50%的捕獲效率）；每個細胞測到的中位基因值為1243，1414（均>1000）。測試結(jié)果表明不管是檢測的細胞數(shù)還是基因數(shù)都是很可觀的呢。

細胞群鑒定結(jié)果是單細胞測序重重要的一個結(jié)果了，沒有之一。為評價FFPE樣本進行單細胞測序得到的細胞鑒定結(jié)果的優(yōu)劣，小編找了一篇Nat Cell Biol（IF：28.213）發(fā)表的用前列腺癌新鮮組織樣本進行單細胞研究的文章進行比較。結(jié)果可看出FFPE樣本（右圖）測序得到的主要細胞類型與新鮮組織樣本（左圖）測序得到的細胞類型基本一致。測試結(jié)果表明基于Flex技術的FFPE樣本單細胞測序能夠鑒定出到豐富的細胞類群。

篇幅有限，這里就不再展示更多結(jié)果。測試結(jié)論就是，基于單細胞基因表達Flex技術可解鎖FFPE樣本研究的新世界！另：伯豪重磅推出FFPE石蠟樣本多組學一站式解決方案，直接將FFPE樣本的研究價值buff加滿！
 

FFPE樣本單細胞轉(zhuǎn)錄組測序應用

FFPE樣本單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的應用領域與已往以新鮮樣本做的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在生長發(fā)育、腫瘤異質(zhì)性、器官圖譜構(gòu)建、神經(jīng)科學、免疫研究以及疾病分子機制/生物標志物等研究領域都有著廣泛的應用。值得注意的是，以FFPE樣本進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序同樣可以應用于這些領域。此外，基于FFPE樣本的特點（如有大量樣本庫，可關聯(lián)患者臨床信息等），F(xiàn)FPE樣本單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在臨床回顧性研究，多組學聯(lián)合分析（尤其是與空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析）等方面更具有獨特的優(yōu)勢。在此獻上全球首篇FFPE空間轉(zhuǎn)錄組分析高分文獻詳解。
 

FFPE樣本單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文章案例

基于Flex技術進行FFPE樣本單細胞RNA測序研究，因為技術較新，目前還沒有正式發(fā)表的文章，下面給大家展示兩篇預印版的案例文章。

案例1：FFPE組織的單細胞+空轉(zhuǎn)+原位分析聯(lián)合繪制高分辨率乳腺癌微環(huán)境圖譜

文章標題：High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue
發(fā)表平臺：bioRxiv
發(fā)表時間：2022年10月
文章摘要：該研究對一個乳腺癌FFPE 樣本進行連續(xù)切片，然后用單細胞基因表達（Chromium Flex，scFFPE-seq)），空間轉(zhuǎn)錄組(Visium CytAssist))，和原位技術(Xenium In Situ)這三種與FFPE樣本兼容的技術對乳腺癌FFPE 樣本進行檢測。通過這三種數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，實現(xiàn)了FFPE樣本單細胞水平下基因表達，空間信息及原位蛋白表達信息的整合。其中scFFPE-seq和Viium數(shù)據(jù)聯(lián)合分析鑒定出17種不同的細胞類型，再通過將轉(zhuǎn)錄本映射到 Xenium 數(shù)據(jù)中，以單細胞分辨率在空間層面上解析這些細胞類型及其基因表達特征，從而展示了樣本高空間分辨的全轉(zhuǎn)錄組信息。
 

圖 用三種互補技術（scFFPE-seq，Visium，Xenium）對單個FFPE樣本進行了聯(lián)合分析

案例2：肺癌患者匹配的新鮮和FFPE癌組織的單細胞RNA譜與臨床特征研究

文章標題：Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffinembedded (FFPE) lung cancer tissue
發(fā)表平臺：bioRxiv
發(fā)表時間：2023年4月
文章摘要：該研究對肺癌患者匹配的新鮮、冷凍和FFPE癌組織的單細胞基因表達譜進行基準測試。研究發(fā)現(xiàn)，新鮮組織和FFPE樣本可以用于在單細胞水平上穩(wěn)健地檢測臨床相關特征，即可以通過單細胞RNA表達譜探究細胞亞型簇顯示出的信號通路、Hallmark等臨床相關信號。此外，與新鮮組織相比，F(xiàn)FPE組織顯示了更高的細胞多樣性，能夠很好地保存細胞類型和患者特征的臨床相關信息。在臨床中，新鮮組織單細胞分析僅允許前瞻性采集樣本，而FFPE組織的單核轉(zhuǎn)錄組學允許用長期臨床隨訪數(shù)據(jù)(如治療反應、復發(fā)、轉(zhuǎn)移和患者存活)的隊列進行回顧性研究�？傊�，來自FFPE組織的單細胞RNA測序與來自新鮮組織的分析相當，可以取代來自新鮮組織的分析。
 

圖 新鮮組織及FFPE樣本snRNA-seq細胞群及細胞亞群鑒定結(jié)果

小編劃重點
不管是我們的測試數(shù)據(jù)，還是實例文章的分析結(jié)果均證明了Flex技術對FFPE樣本進行單細胞RNA測序的穩(wěn)健性及可行性。那M20 Genomics公司的M20技術表現(xiàn)如何呢？兩技術相比又各自有什么優(yōu)劣呢？我們下篇揭曉答案。點擊閱讀《技術比拼之M20技術下的FFPE樣本單細胞RNA測序原理及技術特點》

無論如何，FFPE樣本高通量單細胞測序的新世界大門已經(jīng)打開，想要搶占這第一波紅利的，抓緊上車！