在細胞培養(yǎng)過程中，凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為細胞污染，輕則實驗結(jié)果出不來，重則禍及他人（實驗室），前期投入的人力、物力、財力和長期的堅持都付諸東流。

細胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴重性。一旦發(fā)現(xiàn)有細胞污染，我們該做些什么？


細胞培養(yǎng)中最常見污染的是細菌、真菌、支原體和黑膠蟲污染，判斷細胞是否污染的一種簡單方法是觀察培養(yǎng)基。我們將簡要介紹幾種常見的細胞污染類型及處理方法。

01 細菌污染


 

特征：

◆ 細菌污染時細胞培養(yǎng)基可能在4-6小時呈現(xiàn)混濁。

◆ 有時稍加震蕩，便會有很多混濁物漂起。


◆ 在顯微鏡下呈黑色細沙狀，或背景有大量黑點。



細菌污染可能造成細胞增殖緩慢或形態(tài)上的改變（多角、多核等），胞質(zhì)中產(chǎn)生空泡、細胞漂浮凋亡。

處理方法：
 

抗生素	作用對象	使用比例	儲存條件
卡那霉素溶液	細菌（如G+、G-、支原體）	稀釋:1:100	-20℃
硫酸慶大霉素溶液	細菌（如G+、G-、支原體）	稀釋:1:1000	AMB(15-30℃)
青鏈雙抗	細菌（如G+、G-）	稀釋:1:100	-20℃
青鏈雙抗，10濃縮液	細菌（如G+、G-）	稀釋:1:1000	-20℃
青鏈霉素 制霉菌素三抗	細菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀釋:1:100	-20℃
青鏈霉素 兩性霉素B三抗	細菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀釋:1:100	-20℃
青鏈霉素，新霉素三抗	細菌（如G+、G-）	稀釋:1:100	-20℃

輕度細菌污染可用10X雙抗清洗處理，重度細菌污染建議消殺后丟棄。

 

02真菌污染

特征：
◆ 真菌污染最短3天才能長出橢圓形的霉斑。
◆ 霉斑往往會漂浮在培養(yǎng)液表面，隨著時間逐步擴大。

◆ 有些真菌呈類似棉花絮狀的漂浮物。
◆ 若是念珠菌會呈卵圓狀，在細胞周邊生長。


                                    根霉菌

◆ 早期并不會使得培養(yǎng)基變黃變渾濁，但在顯微鏡下可觀察到菌絲體。真菌形成的菌絲呈絲狀，管狀，樹枝狀，串珠狀。

                                      酵母菌

◆ 酵母菌等，當其行出芽生殖時可從一大一小的連體結(jié)構(gòu)識別。
◆ 細胞被污染后，仍可生長，長時間細胞的活力狀態(tài)會變差。
◆ 梅雨季時的污染率會提高。
◆ 呈卵圓狀酵母菌增殖到一定規(guī)模，形成團簇狀的真菌群。

處理方法：
 

抗生素	作用對象	使用比例	儲存條件
兩性霉素B	真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀釋:1:1000-1:10,000	-20℃
制霉菌素	真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀釋:1:100-1:1000	-20℃
青鏈霉素 制霉菌素三抗	細菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀釋: 1:100	-20℃
青鏈霉素 兩性霉素B三抗	細菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀釋: 1:100	-20℃

細胞真菌污染較難根除，不建議保留，建議消殺后丟棄。
 

03支原體污染
 

最小的微生物，無法通過光學顯微鏡看見，但可通過電鏡觀察到。

感染支原體的細胞，在某一時間點碎片突然增多，隨著傳代，細胞狀態(tài)顯著變差。

細胞支原體污染可通過氣溶膠傳播，影響同一細胞房其他細胞。



 

特征：
◆ 增殖減慢
◆ 上清液清澈
◆ 背景干凈
◆ 細胞形態(tài)異常（拉絲、鋪展）
◆ 更換新的培養(yǎng)液，細胞狀態(tài)沒有恢復

鑒定方法：

PCR法、顯色法、熒光染色法等。
 

示例1►EBTr (牛胚氣管細胞)



     感染支原體的EBTr (牛胚氣管細胞)（成纖維樣）
 

感染了支原體的EBTr特征：1.由成纖維樣逐漸變得類上皮樣；2.質(zhì)膜鋪展，潰爛；3.輪廓不清，邊界模糊；4.凋亡細胞過多。

 

示例2►HT1080 (人纖維肉瘤細胞)


                   被支原體“附身”的HT1080


                          甩掉支原體的HT1080
 

感染了支原體的人纖維肉瘤細胞特征：1.由上皮樣逐漸變得類成纖維樣，胞體細長；2.偽足伸長，出現(xiàn)明顯的拉絲現(xiàn)象。

處理方法：
◆ 若細胞污染后狀態(tài)尚可，添加支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰
◆ 若細胞污染后狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。

04 黑膠蟲污染

“黑膠蟲”可寄生于動物細胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，依靠細胞和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)為生，并隨細胞傳代而傳代，是一種異養(yǎng)生物。

特征：

鏡下無法直接觀察到。主要表現(xiàn)為細胞狀態(tài)差，黑點和碎片多，布朗運動。通過檢測發(fā)現(xiàn)主要為細胞支原體污染，部分為未知的增殖不明顯的微生物污染。

處理方式：

◆ 若細胞污染后狀態(tài)尚可，添加黑膠蟲抑制劑/支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰
◆ 若細胞污染后狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。

二、改善個人操作及培養(yǎng)環(huán)境 

01 清潔培養(yǎng)箱

發(fā)現(xiàn)細胞污染不能只處理這一個培養(yǎng)皿，還得看看這個恒溫培養(yǎng)箱里其他培養(yǎng)皿或孔板里的細胞是否污染。
如果有而且好幾個板子都有類似的污染塊，那很可能是培養(yǎng)箱中的水或者空氣污染了，得給培養(yǎng)箱做個大掃除，重新酒精消毒，照紫外；孵箱里的水，不僅沒了得加還得記得十天半個月的就用酒精擦擦托盤。

02 整理潔凈臺

超凈臺不是儲物箱，什么培養(yǎng)皿、各種規(guī)格的板子、槍頭不要堆在超凈臺，會造成許多紫外線顧不到的衛(wèi)生死角。

細胞房其他的桌面，同樣切忌東西堆積如山，不要將酒精棉球、標簽紙、牛皮紙買來后全部堆在細胞房，污染物一不小心“飄”進你的細胞培養(yǎng)板里，細胞就會死給你看！

03 嚴格無菌操作

細胞房這種衛(wèi)生要求高的地方，人一旦多了救護增加許多不確定因素，難以保證試驗在無菌條件下操作。出入試驗室，實驗服當風衣穿，不扣紐扣，不戴鞋套，猶入無人之境，來去自由；超凈臺做實驗時，喜歡說話聊著做試驗，殊不知你噴口氣，里面就有很多細菌。
 

規(guī)范操作是避免污染的最有效方式。

細胞培養(yǎng)間配備槍式移液器、手術(shù)器械、離心機、冰箱等專用儀器設備以及專用的實驗服和拖鞋，并定期消毒。

專用物品只在培養(yǎng)間內(nèi)使用，不得帶出細胞房。無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞。必要物品可暫時放置，其他實驗用品用完即應移出，以利于氣流的通暢。

培養(yǎng)細胞過程中使用的所有實驗用具，如移液管、一次性槍頭、一次性塑料離心管、凍存管等需121°C高壓滅菌20分鐘后烤干備用，一些玻璃器皿如細胞培養(yǎng)瓶等須先泡酸、洗凈、晾干后再高壓滅菌。