Subvisible Particles in IVIg Formulations Activate Complement in Human Serum
IVIg配方中的亞可見顆粒可活化人血清中的補(bǔ)體

當(dāng)靜脈注射時(shí)，各種顆粒和納米藥物會(huì)激活補(bǔ)體，可能導(dǎo)致輸液反應(yīng)和其他藥物不良反應(yīng)。顆粒在治療蛋白的配方中，由于運(yùn)輸、處理和給病人的治療過程中產(chǎn)生的應(yīng)力形成。在本研究中，IVIg溶液被儲(chǔ)存在多種類型的小瓶和預(yù)填充的注射器中，并暴露在攪拌和凍融應(yīng)力下產(chǎn)生顆粒。將應(yīng)激樣本加入人血清中，以確定這些顆粒是否激活補(bǔ)體。大小在2到10微米的亞可見IVIg顆粒其激活補(bǔ)體的方式與顆粒數(shù)量呈現(xiàn)出線性關(guān)系，而在較大粒子(>10微米)的劑量和補(bǔ)體激活之間幾乎沒有相關(guān)性。通過亞可見顆粒IVIg激活補(bǔ)體是另一種途徑，如補(bǔ)體級(jí)聯(lián)因子Bb的釋放和無C4a生成的過敏性毒素C3a和C5a。亞可見顆粒的數(shù)量和形態(tài)取決于所施加的應(yīng)力、配方和容器材料。但2- 10微米大小的微粒激活人血清補(bǔ)體的能力僅取決于微粒濃度。

介紹
治療性蛋白質(zhì)為多種人類疾病提供有效的治療。然而，在小部分患者中，這些藥物的安全性和有效性受到不良藥物反應(yīng)(ADRs)的影響，包括不良免疫反應(yīng)、輸液反應(yīng)、過敏反應(yīng)，甚至死亡。有些ADR很常見。例如，在大約一半的第一次接觸利妥昔單抗的b細(xì)胞惡性腫瘤的患者的過敏反應(yīng)中，14.5%的患者報(bào)告有嚴(yán)重的輸液反應(yīng)，12.3%的患者對(duì)anti-TNF-a抗體英夫利昔單抗有輸液反應(yīng)。過敏反應(yīng)，超敏反應(yīng)和增加(不希望的)抗體反應(yīng)都可由補(bǔ)體激活引起。補(bǔ)體通常作為一種對(duì)抗病毒和微生物挑戰(zhàn)的生物防御機(jī)制被激活，但是靜脈給藥的納米顆粒也可以激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)。一旦補(bǔ)體級(jí)聯(lián)被激活，就會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的促炎和過敏性反應(yīng)。這些反應(yīng)的強(qiáng)度主要是由補(bǔ)體系統(tǒng)中產(chǎn)生的2種過敏性蛋白C3a和C5a的程度所驅(qū)動(dòng)的。這兩種信號(hào)分子能夠引起血管擴(kuò)張，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，引起組胺的釋放和氧化爆發(fā)，并作為天然免疫細(xì)胞趨化的信號(hào)。

治療性蛋白在生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和給患者使用過程中容易聚集形成可溶性低聚體和亞可見顆粒。這些聚集物是不良免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致治療效果的喪失和其他不良反應(yīng)。蛋白質(zhì)的聚集通常是由蛋白質(zhì)暴露的界面相互作用引起的，例如空氣-水、容器-水和冰水界面。這些界面應(yīng)力可以通過處理放大。例如，在硅油潤(rùn)滑的注射器中發(fā)現(xiàn)的容器水界面上的蛋白質(zhì)的聚集可以通過攪拌大大加速，而治療性蛋白質(zhì)配方中的顆粒水平可以通過凍融顯著增加。我們假設(shè)，像一些納米藥物一樣，蛋白質(zhì)配方處理產(chǎn)生的顆�？赡苣軌蚣せ钛a(bǔ)體。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們首先進(jìn)行了加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，通過使多克隆抗體配方(靜脈免疫球蛋白，IVIg)在多種類型的小瓶中受到冷凍或在多種類型的預(yù)填充注射器中受到攪拌引起的壓力，在多克隆抗體配方中產(chǎn)生顆粒。然后，我們測(cè)試了這些處理誘導(dǎo)的顆粒添加到人類血清樣本中是否能夠激活補(bǔ)體。使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定補(bǔ)體激活程度，以量化補(bǔ)體促炎特性的2個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子C3a和C5a的水平。此外，我們測(cè)定了C4a和Bb的水平，以探索哪些補(bǔ)體通路可能被激活。C4a的產(chǎn)生是補(bǔ)體通過經(jīng)典或凝集素途徑激活的標(biāo)志，而Bb的產(chǎn)生則表明補(bǔ)體通過其它途徑激活。

材料與方法
使用的材料是USP級(jí)或更高。靜脈注射免疫球蛋白(丙種球蛋白;GAMMAGARD LIQUID^®，Shire US Inc.， Lexington, MA)是從科羅拉多大學(xué)博爾德分校的Wardenburg藥房購(gòu)買的。購(gòu)自Sigma Aldrich公司(St. Louis, MO)的化學(xué)品包括磷酸一鈉、磷酸二鈉和甘氨酸。從Fisher Scientific(Waltham，MA)購(gòu)買的化學(xué)品包括聚山梨酯20 (PS20, Tween 20™，N.F.)10倍磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和HyClone™注射水。硅化玻璃注射器為BD催眠SCF 1 mL長(zhǎng)27G1/2 (BD Medical-Pharmaceutical Systems, Franklin Lakes, NJ)。SiOPlas™注射器(1ml) (SiO2 Medical Products, Inc.， Auburn, AL)由環(huán)烯烴聚合物(COP)注射器筒組成，其內(nèi)部表面涂有硅基屏障涂層系統(tǒng)和有機(jī)硅潤(rùn)滑油，均采用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積技術(shù)。SiOPlas™小瓶(6ml)由COP組成，在小瓶?jī)?nèi)部涂覆硅基屏障涂層系統(tǒng)。6 mL Ompi EZ-fill®硼硅玻璃小瓶(Schott, AG)由SiO2 Medical Products, Inc. (Auburn, AL)提供。

蛋白配方
使用前，IVIg的蛋白濃度為1 mg/mL，用pH 7.4的PBS配制，或用pH 4.25的250mm甘氨酸配制，即0.02% (v/v) PS20配制。為了去除任何已存在的顆粒，將含有100 mg/mL免疫球蛋白G在250 mM甘氨酸中的GAMMAGARD LIQUID^®樣品，在4°C, 20000 G離心20分鐘，上清液作為儲(chǔ)存液。將IVIg原液用0.02% (v/v)的PS20稀釋1:100至0.22微米過濾的PBS pH 7.4或250 mM甘氨酸pH 4.25，得到最終濃度為1 mg/mL的IVIg。

對(duì)IVIg配方進(jìn)行攪拌加速應(yīng)力試驗(yàn)
將IVIg配置至0.02% (v/v) PS20與pH 4.25，250 mM甘氨酸溶液中。填充入注射器，使液體和塞子之間有一個(gè)均勻的4毫米的空隙(達(dá)維勒制藥包裝公司，Pennsauken, NJ)。這些注射器在室溫下從頭到尾旋轉(zhuǎn)10天，每旋轉(zhuǎn)一次，頂空間隙中的氣泡就會(huì)從注射器的一端移動(dòng)到另一端。在一些被測(cè)試的注射器中，氣泡會(huì)卡在注射器的一端，并且隨著注射器的旋轉(zhuǎn)而無法移動(dòng)。這些注射器被排除在外，不參與分析。經(jīng)過10天的端到端旋轉(zhuǎn)后，使用自動(dòng)注射泵以150mm /min的速度從注射器中通過針頭排出每種制劑，并在預(yù)先準(zhǔn)備的聚丙烯管中收集樣品，檢測(cè)亞可見顆粒濃度和補(bǔ)體活化能力。
將PBS中填充1mg /mL IVIg的樣品注入到另一組硅化玻璃和SiOPlas™注射器。這些注射器被水平放置在軌道搖床上，在室溫下?lián)u一夜。搖動(dòng)后，使用自動(dòng)注射泵以150mm /min的速度將配方液從注射器中通過針頭排出，收集在預(yù)浸的聚丙烯管中，并檢測(cè)亞可見顆粒濃度和補(bǔ)體活化能力。

IVIg凍融制劑的加速應(yīng)力試驗(yàn)
用含1mg /mL IVIg的4ml配方填充硼硅酸鹽瓶(6ml)和SiOPlas™瓶(6ml)， PBS pH 7.4。小瓶的內(nèi)容物經(jīng)過1或6次凍融循環(huán)。在每個(gè)凍融循環(huán)中，小瓶先在液氮中浸泡2 min，然后在30_C水浴中解凍14.5 min，輕輕旋轉(zhuǎn)攪拌后再進(jìn)行下一個(gè)凍融循環(huán)。

亞可見粒子濃度分析
如前所述，使用流式成像顆粒分析儀(FlowCAM®，F(xiàn)luid imaging Technologies, Scarborough, ME)獲取不同強(qiáng)調(diào)配方中的顆粒濃度和顆粒圖像。經(jīng)過6次凍融循環(huán)的樣品中顆粒濃度接近或超過流動(dòng)成像顯微鏡儀器的上限，因此在分析前用pH 7.4的PBS稀釋100倍。在強(qiáng)調(diào)的配方中，顆粒計(jì)數(shù)被測(cè)量在相同的單個(gè)注射器和小瓶被測(cè)試補(bǔ)體激活的樣本中。每個(gè)樣品都有一個(gè)顆粒大小分布；在測(cè)試強(qiáng)化配方激活補(bǔ)體的能力之前，盡量不讓顆粒分形。
   
從每個(gè)應(yīng)力/容器組合中收集3個(gè)樣品。容器與容器之間的顆粒濃度差別<15%。
 
可溶性蛋白組分的排阻色譜分析
排阻色譜被用來監(jiān)測(cè)單體蛋白的保留和在應(yīng)用攪拌或凍融應(yīng)力后IVIg樣品中任何可溶性聚集物的外觀。TSKgel G3000SWXL柱(TOSOH Biosciences, montgomery yville PA)與Agilent 1100系列柱(Santa Clara, CA)一起使用。洗脫液在安捷倫化學(xué)站軟件中以280 nm的吸光度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。流動(dòng)相為100mm硫酸鈉、100mm磷酸鈉和pH為6.7的0.05% (w/v)疊氮化鈉，以0.6 mL/ min的速度通過系統(tǒng)。色譜圖中的峰面積用GRAMS/AI version 9.1 (Thermo Fisher Scientific Inc.， Waltham, MA)進(jìn)行量化。在應(yīng)用加速應(yīng)力條件后，從(本質(zhì)上)無顆粒、離心和過濾的起始配方的可溶性蛋白的部分損失被量化使用峰面積的比率為應(yīng)力和非應(yīng)力配方。

人類血清樣本中的補(bǔ)體激活
從3個(gè)小瓶或注射器中收集的不同應(yīng)激IVIg制劑的樣品以及每種制劑的非應(yīng)激對(duì)照樣品被送往Exsera BioLabs (Denver, CO)，以分析它們激活補(bǔ)體的能力。補(bǔ)體激活在3個(gè)個(gè)體獻(xiàn)血者的正常血清池中進(jìn)行了測(cè)量，這些獻(xiàn)血者之前曾篩查過補(bǔ)體功能正常。將脅迫的IVIg制劑的試驗(yàn)樣品稀釋10倍到混合的人血清中，混合后在37°C孵育30分鐘。孵育后，樣品在80°C保存，直到進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試。為了分析補(bǔ)體的活化，使用從Quidel公司(San Diego, CA)購(gòu)買的試劑盒，采用ELISA法測(cè)定了四種補(bǔ)體級(jí)聯(lián)活化片段C3a、Bb、C4a和C5a的濃度。選擇C4a是因?yàn)樗�是�?jīng)典或凝集素通路激活的標(biāo)志，Bb是補(bǔ)體激活備選通路的明顯標(biāo)志，C3a是補(bǔ)體激活的中心點(diǎn)，C5a是補(bǔ)體通路終端激活的標(biāo)志。對(duì)四種補(bǔ)體級(jí)聯(lián)蛋白分別進(jìn)行了40次3遍重復(fù)ELISA檢測(cè)。除了測(cè)試應(yīng)激IVIg樣本，還分析了幾個(gè)對(duì)照。這些對(duì)照樣品僅包含混合血清或血清樣品，其中以1:9的比例加入含zymosan的生理鹽水PBS或含熱聚集伽馬球蛋白的PBS。測(cè)量的平均值與顆粒樣本計(jì)數(shù)相比，在鹽水對(duì)照中測(cè)量的濃度增加了一倍。

結(jié)果

IVIg配方的加速應(yīng)力測(cè)試中顆粒的形成
正如預(yù)期的那樣，每種加速應(yīng)力測(cè)試方法都會(huì)在測(cè)試配方中產(chǎn)生微顆粒(表1)。在pH 7.4的PBS條件下，IVIg的凍融產(chǎn)生的亞可見顆粒最多。在硼硅酸鹽和SiOPlas™瓶中，一次凍融循環(huán)分別產(chǎn)生3.2◊10⁵和7.1◊10⁵個(gè)粒徑大于2微米的顆粒。也生產(chǎn)了大于10微米的顆粒，在硼硅酸鹽瓶中檢測(cè)到8.0◊10⁴個(gè)顆粒，在SiOPlas™瓶中檢測(cè)到5.1◊10⁴個(gè)顆粒。

多次凍融循環(huán)使顆粒數(shù)進(jìn)一步增加了約一個(gè)數(shù)量級(jí)(表1)。6次循環(huán)后，硼硅酸鹽瓶和SiOPlas™瓶中的顆粒濃度分別增加到：大于2微米的4.8◊10⁶和2.1◊10⁶個(gè)顆粒/mL。也生成了大于10微米的顆粒，分別在硼硅酸鹽瓶和SiOPlas™瓶中生成2.3◊10⁵和3.6 ◊10⁵個(gè)顆粒。

由于攪拌應(yīng)力而產(chǎn)生的顆粒數(shù)量取決于容器類型和所應(yīng)用的攪拌類型。使用定軌搖床pH值7.4 PBS中的IVIg配方進(jìn)行晝夜不間斷攪拌，在硅化玻璃注射器中產(chǎn)生了大于2微米的顆粒濃度6.0◊10⁵個(gè)/毫升，以及在SiOPlas™注射器中產(chǎn)生了2.4◊10⁶個(gè)顆粒 /毫升，如 (表1)。與凍融研究一樣，兩種類型的注射器形成大顆粒(> 10微米) 的差別約一個(gè)數(shù)量級(jí)。

在“端到端”旋轉(zhuǎn)10天的加速穩(wěn)定性試驗(yàn)中。pH為4.25甘氨酸IVIg制劑在硅化玻璃注射器和SiOPlas™注射器中分別檢測(cè)到粒徑大于2微米的1.0◊10⁵和3◊10³顆粒/mL。相應(yīng)的，大于10微米的顆粒也較少，在硅化玻璃和SiOPlas™注射器中分別檢測(cè)到2.0◊ 10³和90個(gè)顆粒/mL。

圖1展示了由各種加速應(yīng)力方法產(chǎn)生的典型的由流式顆粒成像分析儀（FlowCam）所捕捉到的顆粒圖像。在小瓶中，凍融應(yīng)力下的樣品主要含有具有蛋白質(zhì)聚集物特征的非球形微粒，硅化玻璃注射器中攪拌應(yīng)力下的樣品包含大量球形顆粒，這是滴潤(rùn)滑劑顆粒的特點(diǎn)(圖1 a、c、e和f)。在SiOPlas™注射器中，攪拌應(yīng)力作用下產(chǎn)生顆粒具備形狀不規(guī)則蛋白質(zhì)聚體和球形硅油液滴(圖1 b和d)。

對(duì)于所有的加速應(yīng)力條件測(cè)試，尺寸排除色譜分析顯示，只有<5%的不溶性蛋白形成。在任何條件下均未檢測(cè)到可溶性聚集物。在硼硅玻璃小瓶中，6次凍融循環(huán)使IVIg產(chǎn)生的顆粒濃度最高，達(dá)到大于2微米顆粒500萬個(gè)/毫升，但這僅表示損失了3.7%的原始單體蛋白。

在加速應(yīng)激條件下產(chǎn)生的顆粒對(duì)人血清中的補(bǔ)體激活
當(dāng)IVIg配方被稀釋10倍于人血清時(shí)，在加速應(yīng)激條件下，IVIg配方中大于2微米的顆粒與激活補(bǔ)體呈線性關(guān)系(圖2-4)。在大于10微米顆粒數(shù)量較多的樣本中，補(bǔ)體激活水平通常較高，但這些較大顆粒的水平較低，不能明確的劑量的相關(guān)性見圖5。

觀察到的補(bǔ)體激活與通過替代途徑的激活一致。沒有增加C4a鹽水控制水平,這是一個(gè)典型的標(biāo)志或凝集素途徑(圖6)。相比之下,Bb,補(bǔ)體激活的標(biāo)記的替代途徑,增加線性(r²=0.94)的濃度大于2微米粒子尺寸范圍的增加(圖2)。

增加過敏毒素的濃度C3a Ca5也觀察到當(dāng)粒子被稀釋到血清(圖3和4)。與Bb響應(yīng),褶皺增加與鹽水控制線性依賴于粒子的劑量,與相關(guān)系數(shù)r2 C3a和ca5的0.85和0.99,分別。對(duì)IVIg配方的反應(yīng)，在硼硅酸鹽玻璃小瓶中經(jīng)過6次凍融循環(huán)后，C3a和C5a的濃度增加了2.4- 8.9倍，比在生理鹽水對(duì)照組中觀察到的要高。

作為比較，含有1 mg/mL zymosan或1 mg/L熱聚集伽馬球蛋白的陽(yáng)性對(duì)照可刺激C3a、Bb和C4a約11倍(與生理鹽水相比)，C5a水平約32倍(與生理鹽水相比)。
圖1所示。使用流式顆粒成像分析儀（FlowCam）對(duì)不同應(yīng)力條件下IVIg樣品進(jìn)行檢測(cè)。這些圖片是在眾多顆粒圖片中隨機(jī)選取的：(a)在定軌搖床上經(jīng)過隔夜攪拌，玻璃注射器中的IVIg樣品；(b)使用用SiOPlas™注射器在定軌搖床上攪拌的樣品；(c)硅油潤(rùn)滑玻璃注射器的端到端旋轉(zhuǎn)10天；(d) SiOPlas™注射器的端到端旋轉(zhuǎn)10天；(e)玻璃瓶?jī)?nèi)凍融6次；(f) SiOPlas™瓶中凍融6次。
  圖2。樣品顆粒水平對(duì)人體血清樣品Bb濃度的影響。在生理鹽水對(duì)照樣品中，隨著倍數(shù)的增加，濃度被報(bào)告為Bb水平。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，相關(guān)系數(shù)為r²=0.94。
  圖3。樣品顆粒水平對(duì)人體血清中C3a濃度的影響。在生理鹽水對(duì)照樣品中，濃度隨著濃度的增加而增加。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，相關(guān)系數(shù)為r²=0.85。
  圖4。樣品顆粒水平對(duì)人體血清中C5a濃度的影響。據(jù)報(bào)道，在生理鹽水對(duì)照樣品中，fold相對(duì)于C5a水平升高。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，相關(guān)系數(shù)為r²=0.99。
  圖5。10微米以上顆粒濃度對(duì)人血清樣品中C5a(填充圓)和C3a(開放圓)濃度的影響據(jù)報(bào)道，在生理鹽水對(duì)照樣品中，濃度隨C5a和C3a水平的增加而增加。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，C5a和C3a相關(guān)系數(shù)分別為r²=0.60和r²= 0.47。
  圖6。IVIg樣本中的蛋白顆粒沒有刺激C4a濃度在人血清樣本中的釋放。據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在生理鹽水對(duì)照樣品中，fold與C4a水平相比濃度增加了。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，相關(guān)系數(shù)為r²=0.005。

討論

亞可見顆粒普遍存在于治療性蛋白質(zhì)的配方中，但在運(yùn)輸、處理和儲(chǔ)存過程中遇到的應(yīng)力變化會(huì)大大增加它們的水平。在運(yùn)輸和液體的日常處理過程中，由于振動(dòng)引起的攪動(dòng)壓力。盡管治療蛋白的液體配方通常在受控溫度下保持液態(tài)，但意外凍結(jié)可能發(fā)生，特別是用凝膠包冷卻的容器中，或在用于家庭管理的配方中，冷凍會(huì)在運(yùn)輸過程中發(fā)生。在這里測(cè)試的多克隆抗體配方中，當(dāng)預(yù)先填充的注射器中的IVIg配方受到攪拌時(shí)，或當(dāng)配方在小瓶中被凍融時(shí)，可以看到顆粒水平的增加。目前研究旨在調(diào)查蛋白配方中的亞可見顆粒是否提高補(bǔ)體激活的能力，所以我們使用了各種配方和加速壓力條件下創(chuàng)建樣本顆粒的大小和濃度,但我們沒有試圖闡明每個(gè)應(yīng)力的詳細(xì)機(jī)制促進(jìn)粒子的形成。

凍融試驗(yàn)后觀察到的顆粒濃度取決于藥瓶類型和配方所受凍融循環(huán)次數(shù)。經(jīng)過6次凍融循環(huán)，每mL樣品可產(chǎn)生數(shù)百萬個(gè)大于2mm的顆粒，數(shù)十萬個(gè)大于10mm的顆粒。有趣的是，在玻璃瓶中經(jīng)過多次凍融循環(huán)的樣品比在聚合物SiOPlas™瓶中冷凍的樣品產(chǎn)生了更多的顆粒。我們推測(cè)，與那些在更靈活的循環(huán)聚烯烴瓶中所經(jīng)歷的相比，玻璃瓶中更多的顆粒是由于冰在剛性玻璃瓶中膨脹時(shí)產(chǎn)生了更高的機(jī)械應(yīng)力造成的。

注射器中IVIg配方的攪動(dòng)所產(chǎn)生的顆粒數(shù)取決于所施加的攪動(dòng)應(yīng)力的強(qiáng)度、緩沖條件和注射器類型。在平板搖床上進(jìn)行高強(qiáng)度通宵攪拌所產(chǎn)生的顆粒比低強(qiáng)度、端到端旋轉(zhuǎn)10天所產(chǎn)生的顆粒要多。攪拌硅油潤(rùn)滑的預(yù)填充注射器會(huì)產(chǎn)生硅油液滴特征的球形顆粒，以及少量非球面的、近乎半透明的典型蛋白質(zhì)聚集顆粒，這些顆�？雌饋硎怯晒栌鸵旱魏途奂�的蛋白質(zhì)組成的。SiOPlas™注射器中產(chǎn)生的顆粒較少，其中等離子體化潤(rùn)滑層比液態(tài)硅油潤(rùn)滑層更不容易被流體剪切和界面張力從表面去除。

補(bǔ)體活化是一種不良反應(yīng)，與許多納米藥物中的納米顆粒存在有關(guān)。雖然許多類型的納米顆粒已被證明可以激活補(bǔ)體，但也有其他納米顆粒表現(xiàn)出最小程度的補(bǔ)體激活。納米顆粒誘導(dǎo)的補(bǔ)體活化可通過經(jīng)典途徑、凝集素途徑或其他途徑發(fā)生。通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體是抗原結(jié)合的IgG激活的一個(gè)特征。當(dāng)與抗原結(jié)合的Igg的Fc區(qū)域組裝形成六聚體復(fù)合物時(shí)，就會(huì)發(fā)生這種激活。相比之下，在本例中，Bb水平的增加對(duì)IVIg配方中的顆粒的響應(yīng)表明補(bǔ)體是通過另一種途徑激活的，可能是通過非特異性結(jié)合，不同于Fc介導(dǎo)的天然IgG功能的激活特征。蛋白質(zhì)顆粒通過替代途徑誘導(dǎo)補(bǔ)體活化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)尚不完全清楚，但對(duì)于其他納米顆粒，替代途徑活化是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)蛋白C3非共價(jià)沉積在顆粒表面所致。

在IVIg配方中，補(bǔ)體對(duì)操作誘導(dǎo)顆粒的激活是很強(qiáng)的。即使在我們測(cè)試的產(chǎn)生最多微粒的凍融條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)仍以單體形式可溶。例如，在玻璃瓶中經(jīng)過6次凍融循環(huán)后，根據(jù)HPLC分析的單體損失，只有3.7%的原1 mg/mL的單體蛋白聚集在37微克/mL的顆粒上。然而，這少量的集合體引發(fā)了Bb、C3a和C5a的釋放，其釋放水平大約是1 mg/mL陽(yáng)性對(duì)照酵母聚糖和熱聚集伽馬球蛋白釋放水平的四分之一。

應(yīng)用于玻璃和SiOPlas™容器中的IVIg配方的凍融和攪拌應(yīng)力產(chǎn)生了跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí)的顆粒數(shù)，通過流式顆粒成像分析儀（FlowCam）分析顆粒時(shí)，觀察到不同的特征形態(tài)。然而，當(dāng)在一個(gè)檢查全面顆粒的基礎(chǔ)上，顆粒激活補(bǔ)體的傾向不取決于顆粒的形態(tài)。值得注意的是，流動(dòng)成像顯微鏡對(duì)具有微米級(jí)特征的顆粒形態(tài)特征很敏感。有可能在更精細(xì)的尺度上，不同顆粒類型中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能是相似的，因此每個(gè)顆粒的補(bǔ)體活化水平相似。

表面活性劑的微粒如PS20和聚山梨酯80已被證明能夠激活補(bǔ)體。但在本例中，補(bǔ)體激活似乎并不強(qiáng)烈依賴于表面活性劑的濃度，因?yàn)樘砑覲S20和不添加PS20的劑型之間顆粒劑量依賴性是無法區(qū)分的。

我們觀察到的補(bǔ)體激活與小于10微米的顆粒濃度呈線性相關(guān)性。補(bǔ)體的激活也普遍存在于大顆粒（大于10微米）數(shù)量最高的樣本中 (見圖5)，這些較大的顆粒在不同應(yīng)力條件下的IVIg樣品中被發(fā)現(xiàn)，但是其濃度比較小顆粒的2- 10微米大小的顆粒的相應(yīng)濃度低大約一個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，對(duì)于補(bǔ)體的激活是否依賴于大于10微米的顆粒，我們的實(shí)驗(yàn)并不能確定。有趣的是，更小的亞微米顆粒目前還沒有在腸外給藥的蛋白質(zhì)產(chǎn)品有明確規(guī)定‘；國(guó)藥典< USP 787/788 >中描述的顆粒含量限制僅適用于大于10微米和大于25微米的顆粒。監(jiān)測(cè)小于10微米的顆粒，可以洞察治療蛋白制劑的潛在免疫原性和補(bǔ)體激活能力。

在將這些結(jié)果擴(kuò)展到預(yù)測(cè)補(bǔ)體激活引起的藥物不良反應(yīng)時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎使用。由于遺傳和后天因素的影響，補(bǔ)體激活的閾值和程度可能因患者而異，從而直接預(yù)測(cè)顆粒在體內(nèi)的反應(yīng)是有問題的。此外，體外試驗(yàn)中使用的無細(xì)胞血清可能低估了顆粒激活補(bǔ)體的能力;在全血中，B細(xì)胞的存在增加了患者對(duì)利妥昔單抗激活補(bǔ)體的敏感性。最后，納米顆粒對(duì)補(bǔ)體的激活可能具有高度的物質(zhì)特異性，并且由其他蛋白藥物形成的顆粒，例如單克隆抗體，可能與IVIg中存在的多克隆抗體混合物中的顆粒行為不相似。

結(jié)論

我們觀察到，在基于血清的體外試驗(yàn)中， IVIg制劑產(chǎn)生一次意外凍融就能產(chǎn)生足夠數(shù)量的顆粒來激活補(bǔ)體。對(duì)于受應(yīng)力樣品中2- 10微米大小的顆粒，補(bǔ)體激活與顆粒濃度成正比，而對(duì)于相同樣品中>10微米的顆粒，則沒有觀察到明顯的關(guān)聯(lián)性�；罨�補(bǔ)體的水平與多種應(yīng)力產(chǎn)生的特定顆粒形態(tài)無相關(guān)性，也與配方中非離子表面活性劑的存在無相關(guān)性。雖然這些結(jié)果可能不是很容易對(duì)病人注射了其他單克隆抗體藥物產(chǎn)品后產(chǎn)生的藥物不良反應(yīng)進(jìn)行定量預(yù)測(cè)，明智的做法顯然是采取措施來規(guī)范處理,存儲(chǔ)和管理治療蛋白質(zhì)產(chǎn)品以減少顆粒物產(chǎn)生。重要的是需要監(jiān)測(cè)10微米以下大小的微粒來洞察免疫原性。