癌癥是世界上死亡率最高的一種疾病，如果不能在早期階段被診斷出來，會使病人陷入長期痛苦的治療過程或逐漸死亡。然而，對于早期癌癥的篩查，仍然缺乏一種速度快、成本效益高、敏感性強(qiáng)的檢測手段。實現(xiàn)這種技術(shù)的困難在于，癌癥是由各種遺傳因素和表觀遺傳改變引起的，比如基因突變，腫瘤來源的DNA片段，稱為循環(huán)腫瘤（ct）DNA，可以在癌癥患者的血液中被發(fā)現(xiàn)，但只占細(xì)胞游離（cf）DNA的一小部分。在癌癥的早期階段和健康個體中，cfDNA的濃度非常低，健康個體的血漿cfDNA濃度在1.7 ng/mL到30.8 ng/mL之間。為了區(qū)分腫瘤來源的DNA和健康細(xì)胞的野生型DNA，必須對某些基因的DNA序列進(jìn)行突變分析。

PIK3CA基因比較容易發(fā)生突變且存在PIK3CA突變的腫瘤一般預(yù)后不良，因為PIK3CA基因突變，會激活下游的AKT信號通路，減少細(xì)胞對生長因子的依賴，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。PIK3CA基因主要編碼磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶的催化亞基p110，該基因主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，多數(shù)情況下處于非激活狀態(tài)，一旦發(fā)生突變PIK3CA被異常激活，相關(guān)蛋白過度表達(dá)，從而促使細(xì)胞發(fā)生癌變，如形成乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、腦癌或子宮內(nèi)膜癌。乳腺癌是一種女性最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著全球女性的身心健康。在乳腺中PIK3CA基因的突變極為常見，比例約35%，相關(guān)的突變位點分別是H1047R、E545K和E542K，它們都是由單核苷酸變化引起的。對PIK3CA點突變的特異性檢測對癌癥早期篩查，預(yù)測抗癌治療反應(yīng)，以及癌癥監(jiān)測具有重要意義。
 

該文章于2022年9月發(fā)表在Talanta Open雜志，作者來自于維也納大學(xué)物理與化學(xué)學(xué)院的Peter Lieberzeit教授團(tuán)隊。作者構(gòu)建了不同突變位點的寡核苷酸序列作為捕獲探針與紅色熒光標(biāo)記的目的片段進(jìn)行雜交，其中H1047R構(gòu)建了9種突變探針（分別是5-10號位，基因序列中心位，3'端以及5'端），E545K設(shè)計了1種（5號位突變），E542K（5號位突變）1種以及1組對照寡核苷酸序列。捕獲探針固定于載體后與突變的目的基因序列進(jìn)行雜交，只有在突變位點兩個堿基可以相互配對才能產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號以及電信號。作者主要采用兩種方式進(jìn)行檢測分析，一種方法使用英國ArrayJet生物芯片點樣儀來制備高通量的探針芯片進(jìn)行篩選，一種采用電化學(xué)的方式進(jìn)行電信號分析，具體流程見圖1。

在采用不同長度的突變體和野生型靶DNA寡核苷酸（24-mer和80-mer）檢測時發(fā)現(xiàn)完美雜交的歸一化熒光強(qiáng)度均高于錯配雜交，因此兩者都可以區(qū)分突變型和野生型目的DNA。然而，80-mer的目的DNA熒光強(qiáng)度低于24-mer，這可能由于長片段的目的DNA在5'端產(chǎn)生了空間位阻進(jìn)而降低了兩者的雜交效率，具體結(jié)果見圖2。

總結(jié)：通過微陣列實驗和酶擴(kuò)增電化學(xué)方法成功檢測了3個與乳腺癌相關(guān)的PIK3CA點突變（PIK3CA H1047R、PIK3CA E545K和PIK3CA E542K），證明了該方法的高特異性，同時本研究的結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)具有高靈敏度和高選擇性的疾病檢測手段奠定了基礎(chǔ)。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.talo.2022.100150

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