一文讀懂原核蛋白表達
1.原核表達概念
蛋白表達是指用模式生物如細菌、酵母、動物細胞或者植物細胞表達外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。原核蛋白表達是指通過基因克隆技術(shù)，將外源目的基因，通過構(gòu)建表達載體并導(dǎo)入表達菌株的方法，使其在特定原核生物或細胞內(nèi)表達。
2.原核蛋白表達系統(tǒng)優(yōu)缺點
常見的蛋白表達系統(tǒng)有原核、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物表達系統(tǒng)，其中最經(jīng)濟最實惠的是原核蛋白表達系統(tǒng)，四種常見表達系統(tǒng)區(qū)別如下表1：
表1：常見蛋白表達系統(tǒng)區(qū)別
蛋白表達量：原核＞酵母＞哺乳，昆蟲系統(tǒng)與原核和酵母接近，選擇合適的蛋白表達系統(tǒng)還需要根據(jù)您的實驗成本、周期等一系列因素綜合考量，目前最常用的是原核蛋白表達系統(tǒng)，原核表達體系常用的宿主為大腸桿菌和枯草桿菌，前者表達量高，后期產(chǎn)品需要去除內(nèi)毒素；后者蛋白產(chǎn)量相對較低，但不產(chǎn)生內(nèi)毒素，主要區(qū)別如下圖所示：
3.原核蛋白表達系統(tǒng)組成
一個完整的蛋白表達系統(tǒng)通常包括宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。
3.1宿主菌
原核蛋白常見宿主菌系列為BL21（DE3）、Rosetta系列菌株。
3.2外源基因
由于外源基因具有多樣性，高效表達外源基因須考慮優(yōu)化密碼子，提高外源基因 mRNA 的穩(wěn)定性，優(yōu)化載體設(shè)計等。
3.3表達載體
原核蛋白表達載體質(zhì)粒包括復(fù)制子(Replicon)、啟動子(promoter)、篩選標簽(selection marker)、多克隆位點（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy)，常見的原核表達載體pET-28a（+）、pGEX-4T-1、pET SUMO，原核表達質(zhì)粒載體如圖所示：
3.4其他組成（融合標簽）
蛋白重組表達過程中采用親和標簽融合表達有兩方面的作用：一方面是為了使蛋白純化過程變得更加容易；另一方面是為了促進某些不溶性蛋白可溶。融合標簽選擇可參考卡梅德官網(wǎng)列表。
4.原核蛋白表達系統(tǒng)應(yīng)用方向
原核表達系統(tǒng)有非常良好的應(yīng)用前景。根據(jù)查詢相關(guān)公開信息顯示，原核表達系統(tǒng)可以用于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白，如藥物、疫苗、抗體等，從而為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了有力的支持，原核表達系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)植物和動物的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗菌肽、抗蟲蛋白等，從而提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，降低農(nóng)藥使用量，保障食品安全。同時，原核表達系統(tǒng)也可以用于生產(chǎn)工業(yè)酶、生物染料等，具有高效、低成本、環(huán)保等優(yōu)點，為工業(yè)生產(chǎn)提供了新的途徑。
5.原核蛋白表達全流程介紹
原核蛋白表達大致實驗流程圖如下：
5.1優(yōu)化密碼子
大腸桿菌對密碼子的使用頻率不同，有最佳密碼子，偏好密碼子，一般選擇使用頻率大于20%的密碼子�；蛐蛄薪�(jīng)過優(yōu)化，能提高mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，避免tRNA庫數(shù)量不充足延遲/終止翻譯，翻譯移碼和氨基酸錯配等情況。
5.2目的基因合成
通過PCR方法，以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
5.3表達載體構(gòu)建
選擇合適的載體，常見原核表達載體是pET系列、pGEX-4T-1、pET-SUMO等，將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳，PCR產(chǎn)物雙酶切后回收。
5.4轉(zhuǎn)化表達菌株
原核蛋白使用BL21（DE3）、Rosetta系列菌株，將質(zhì)粒載體在連接酶作用下轉(zhuǎn)化到RosseStta BL21菌株，通過涂布TB（含50ug/ml kana）平板篩選，挑取單克隆進行活化培養(yǎng)。
5.5蛋白表達鑒定
從TB平板中挑取單克隆活化培養(yǎng)至菌體OD600為0.6-0.8時，IPTG進行37℃誘導(dǎo)4h表達，取誘導(dǎo)表達前與誘導(dǎo)后各條件的菌體制樣進行SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)表達結(jié)果如圖：
5.6蛋白放大表達與純化
5.6.1放大表達
取能夠表達目的蛋白的BL21菌株，接種到1L TB培養(yǎng)基，加入IPTG誘導(dǎo)12h，離心，收集菌泥，超聲破碎后收集上清和沉淀，如下圖放大誘導(dǎo)表達結(jié)果：
5.6.2純化
上清純化：過濾膜上Ni柱親和富集純化，SDS-PAGE分析。
包涵體（沉淀）純化：緩沖液洗脫上Ni柱親和富集純化，SDS-PAGE分析，純化結(jié)果如下圖：
蛋白表達是指用模式生物如細菌、酵母、動物細胞或者植物細胞表達外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。原核蛋白表達是指通過基因克隆技術(shù)，將外源目的基因，通過構(gòu)建表達載體并導(dǎo)入表達菌株的方法，使其在特定原核生物或細胞內(nèi)表達。
2.原核蛋白表達系統(tǒng)優(yōu)缺點
常見的蛋白表達系統(tǒng)有原核、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物表達系統(tǒng)，其中最經(jīng)濟最實惠的是原核蛋白表達系統(tǒng)，四種常見表達系統(tǒng)區(qū)別如下表1：
表1：常見蛋白表達系統(tǒng)區(qū)別
| 表達系統(tǒng) | 優(yōu)點 | 缺點 |
| 原核 | 經(jīng)濟實惠，表達量高 | 不能進行糖基化修飾，形成包涵體；產(chǎn)生內(nèi)毒素 |
| 酵母 | 表達量高，有翻譯后修飾功能，可大規(guī)模表達 | 缺乏強有力的受嚴格調(diào)控的啟動子，分泌效率低 |
| 哺乳動物 | 產(chǎn)品的抗原性、免疫源性與天然蛋白最接近，糖基化準確 | 產(chǎn)量低 |
| 昆蟲 | 糖基化形式較低，表達形式單一 | 成本高，表達量低 |
| 植物 | 易于大規(guī)模培養(yǎng) | 轉(zhuǎn)基因植物費用高，表達量難提高，分離純化不便 |
蛋白表達量：原核＞酵母＞哺乳，昆蟲系統(tǒng)與原核和酵母接近，選擇合適的蛋白表達系統(tǒng)還需要根據(jù)您的實驗成本、周期等一系列因素綜合考量，目前最常用的是原核蛋白表達系統(tǒng)，原核表達體系常用的宿主為大腸桿菌和枯草桿菌，前者表達量高，后期產(chǎn)品需要去除內(nèi)毒素；后者蛋白產(chǎn)量相對較低，但不產(chǎn)生內(nèi)毒素，主要區(qū)別如下圖所示：
3.原核蛋白表達系統(tǒng)組成
一個完整的蛋白表達系統(tǒng)通常包括宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。
3.1宿主菌
原核蛋白常見宿主菌系列為BL21（DE3）、Rosetta系列菌株。
3.2外源基因
由于外源基因具有多樣性，高效表達外源基因須考慮優(yōu)化密碼子，提高外源基因 mRNA 的穩(wěn)定性，優(yōu)化載體設(shè)計等。
3.3表達載體
原核蛋白表達載體質(zhì)粒包括復(fù)制子(Replicon)、啟動子(promoter)、篩選標簽(selection marker)、多克隆位點（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy)，常見的原核表達載體pET-28a（+）、pGEX-4T-1、pET SUMO，原核表達質(zhì)粒載體如圖所示：
蛋白重組表達過程中采用親和標簽融合表達有兩方面的作用：一方面是為了使蛋白純化過程變得更加容易；另一方面是為了促進某些不溶性蛋白可溶。融合標簽選擇可參考卡梅德官網(wǎng)列表。
4.原核蛋白表達系統(tǒng)應(yīng)用方向
原核表達系統(tǒng)有非常良好的應(yīng)用前景。根據(jù)查詢相關(guān)公開信息顯示，原核表達系統(tǒng)可以用于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白，如藥物、疫苗、抗體等，從而為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了有力的支持，原核表達系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)植物和動物的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗菌肽、抗蟲蛋白等，從而提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，降低農(nóng)藥使用量，保障食品安全。同時，原核表達系統(tǒng)也可以用于生產(chǎn)工業(yè)酶、生物染料等，具有高效、低成本、環(huán)保等優(yōu)點，為工業(yè)生產(chǎn)提供了新的途徑。
5.原核蛋白表達全流程介紹
原核蛋白表達大致實驗流程圖如下：
5.1優(yōu)化密碼子
大腸桿菌對密碼子的使用頻率不同，有最佳密碼子，偏好密碼子，一般選擇使用頻率大于20%的密碼子�；蛐蛄薪�(jīng)過優(yōu)化，能提高mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，避免tRNA庫數(shù)量不充足延遲/終止翻譯，翻譯移碼和氨基酸錯配等情況。
5.2目的基因合成
通過PCR方法，以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
5.3表達載體構(gòu)建
選擇合適的載體，常見原核表達載體是pET系列、pGEX-4T-1、pET-SUMO等，將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳，PCR產(chǎn)物雙酶切后回收。
5.4轉(zhuǎn)化表達菌株
原核蛋白使用BL21（DE3）、Rosetta系列菌株，將質(zhì)粒載體在連接酶作用下轉(zhuǎn)化到RosseStta BL21菌株，通過涂布TB（含50ug/ml kana）平板篩選，挑取單克隆進行活化培養(yǎng)。
5.5蛋白表達鑒定
從TB平板中挑取單克隆活化培養(yǎng)至菌體OD600為0.6-0.8時，IPTG進行37℃誘導(dǎo)4h表達，取誘導(dǎo)表達前與誘導(dǎo)后各條件的菌體制樣進行SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)表達結(jié)果如圖：
5.6蛋白放大表達與純化
5.6.1放大表達
取能夠表達目的蛋白的BL21菌株，接種到1L TB培養(yǎng)基，加入IPTG誘導(dǎo)12h，離心，收集菌泥，超聲破碎后收集上清和沉淀，如下圖放大誘導(dǎo)表達結(jié)果：
5.6.2純化
上清純化：過濾膜上Ni柱親和富集純化，SDS-PAGE分析。
包涵體（沉淀）純化：緩沖液洗脫上Ni柱親和富集純化，SDS-PAGE分析，純化結(jié)果如下圖：
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