2023年2月9日，浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院的最新研究成果，發(fā)表在Molecular Plant期刊上(影響因子21.949)，文章題目為“Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in Gossypium bickii”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術鑒定了比克氏棉子葉GoPGF的結合基序和下游靶基因。并進一步揭示了比克氏棉色素腺形態(tài)建成的調控網(wǎng)絡，為培育具有特定性狀的栽培棉花新品種提供了寶貴的基因資源。

從萌發(fā)的比克氏棉子葉中分離原生質體，進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），保留了12222個單細胞轉錄組數(shù)據(jù)用于下游分析。聚類為14個不同的細胞簇，這些細胞在已知的細胞標記基因的輔助下被分為8個細胞類群，包括：葉肉細胞(MC)、色素腺細胞(PG)、表皮細胞(EC)、保衛(wèi)細胞(GC)、木質部細胞(XC)、原形成層細胞(PC)、韌皮部薄壁細胞(PP)和伴胞(CC)。色素腺細胞群與其他細胞群的分離效果良好，并進一步分為色素腺薄壁細胞、分泌細胞和凋亡細胞。隨后，通過分析3種色素腺細胞的連續(xù)分化軌跡，初步闡明了色素腺的發(fā)育模式。

圖1. 棉花子葉單細胞轉錄圖譜的構建

轉錄因子是植物所有生物過程的關鍵調控因子，包括色素腺的形成。在色素腺細胞中鑒定的轉錄因子，大多數(shù)與色素腺薄壁細胞的分化有關，包括bHLH、AP2/ERF、C2H2、GRAS、NAC和WRKY。從薄壁細胞向分泌細胞的轉變受AP2/ERFs和WRKYs的調控，而從分泌細胞向凋亡細胞的轉變受MYBs的調控。GoPGF是一種bHLH轉錄因子，已被證明在色素腺薄壁細胞起始中發(fā)揮重要作用，但調控色素腺形態(tài)發(fā)生的轉錄調控網(wǎng)絡仍不清楚。采用DAP-seq分析對GoPGF下游靶基因進行鑒定，并通過整合DAP-seq和scRNA-seq的結果，構建了一個以GoPGF為hub基因的轉錄調控網(wǎng)絡。

圖2. 調節(jié)色素腺細胞發(fā)育的轉錄因子網(wǎng)絡

接下來，利用病毒介導的基因沉默系統(tǒng)對8個與色素腺形成相關的轉錄因子進行基因沉默，其中包括3個新基因GbiERF114（AP2/ERF），GbiZAT11（C2H2）和GbiNTL9（NAC），以及5個已知的同源基因GbiCGF1(bHLH)，GbiGoPGF(bHLH)，GbiGoSPGF(GRAS)，GbiCGP1(MYB)和GbiCGF2(NAC)，這些基因的沉默顯著影響幼苗葉片和莖中色素腺的發(fā)育及其棉酚含量。因此，這些類型的轉錄因子可能在棉花色素腺的形成中起重要作用。通過功能富集分析、順式調節(jié)元件分析，還發(fā)現(xiàn)光和赤霉素可以促進色素腺的形成。

圖3. 轉錄因子在色素腺發(fā)育中的功能驗證

小結：該研究整合了色素腺細胞的發(fā)育軌跡、轉錄因子調控網(wǎng)絡和核心轉錄因子的功能驗證，提出了一個相對完整的色素腺形態(tài)建成模型。同時，解析了GoPGF和其他轉錄因子在色素腺形成中的作用機制。此外，還發(fā)現(xiàn)了3個與色素腺體形成相關的功能基因（GbiERF114、GbiZAT11、GbiNTL9）以及光和赤霉素促進色素腺形成這一現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)為棉花色素腺的形態(tài)建成提供了新的見解，為栽培棉花新品種培育提供了珍貴的基因資源。