花青素(Anthocyanidin)是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于類黃酮化合物。水果、蔬菜、花卉的顏色大部分與之有關(guān)�；ㄇ嗨啬軌蛱岣咧参镉^賞價值，花青素的抗氧化功能對人體健康有積極作用。花青素已被用于健康補充劑的成分。因此，培育高含量花青素的植物是一個重要目標(biāo)。

北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室、齊魯師范大學(xué)玉米分子育種研究院的共同研究成果，于2022年7月5日在國際知名學(xué)術(shù)期刊Theoretical and Applied Genetics上發(fā)表(影響因子為5.574)，題目為“ A newly characterized allele of ZmR1 increases anthocyanin content in whole maize plant and the regulation mechanism of diferent ZmR1 alleles”。本文主要研究內(nèi)容是鑒定了玉米花青素合成相關(guān)等位基因ZmR1^CQ01，并揭示了3個ZmR1等位基因的生物學(xué)功能和分子調(diào)控機制。

 

研究背景

玉米中的花青素對人類的健康具有積極作用。R1基因家族調(diào)控花青素的組織特異性分布。R1基因的等位基因變異較為豐富，然而其生物學(xué)功能和分子調(diào)控機制尚不清楚。

 

研究材料

玉米自交系 CQ01、ZN3、B73、B104、WMR，京紫糯219 (ZN3×CQ01)，京724，京92、京科968 (京724×京92)，B73 zmr1 EMS突變體，以及本研究中用到的多個遺傳材料。

 

研究結(jié)果

CQ01玉米植株的多種器官(葉鞘、葉脈、苞片、葉、莖、種子皮、支撐根等) 中都存在花青素色素沉著現(xiàn)象。然而B73植株的花青素主要積累在近地葉鞘和支撐根中。

圖1：玉米自交系CQ01葉片中脈花青素含量和成分分析以及花青素調(diào)控基因的定位

(a)玉米自交系CQ01和B73的葉中脈。(b) CQ01生長30天后葉中脈的花青素含量。(c) LC-MS/MS在不同掃描波長下的信號強度。(d) LC-MS/MS檢測花青素的保留時間和信號強度。(e) 花青素組成成分檢測。(f)BSR-seq分析將花青素調(diào)控基因定位到10號染色體 (B73 RefGen_v3)。(g) 采用滑動窗口法將花青素調(diào)控基因定位到10號染色體132-140Mb區(qū)間。(h) 利用CQ01(紫色中脈)和ZN3(綠色中脈)之間具有SNP多態(tài)性的13個KASP分子標(biāo)記，對465個京紫糯219 (ZN3×CQ01)的F2代個體進行精細(xì)定位，將葉中脈花青素調(diào)控基因定位于KASP-15和KASP-19標(biāo)記之間的404kb區(qū)間。

 

通過CQ01和B73雜交的F2代種群分離實驗 (綠色中脈:紫色中脈=1:3) 發(fā)現(xiàn)，CQ01的紫色葉中脈由一個顯性基因控制。通過BSR-seq分析及精細(xì)遺傳定位發(fā)現(xiàn)玉米葉中脈的花青素色素沉著由第10號染色體上的ZmR1基因控制。

圖2：過表達ZmR1和過表達ZmR1^CQ01的京724的不同組織中花青素的積累

(a) ZmR1過表達載體的結(jié)構(gòu)。(b) 野生型京724和5個獨立的過表達ZmR1^CQ01的京724(T0代)中花青素積累的表現(xiàn)型。(c-m) 野生型京724和過表達ZmR1^CQ01的京724的不同組織中的花青素積累�；ㄇ嗨卦谟衩琢�(c)、胚芽鞘(d和e)、玉米須(f和j)、苞片(f和j)、葉(g和k)、葉中脈(g和k)、葉鞘(h和l)、莖(h和l)、花藥(i和m)和雄花序(i和m)中積累。

 

ZmR1^CQ01是從紫色玉米中獲得的一個新的ZmR1等位基因。該基因的過表達會導(dǎo)致整個玉米植株變成紫色。

圖3：玉米zmr1 EMS突變體的等位基因檢測及ZmR1的亞細(xì)胞定位

(a) 3個B73 zmr1 EMS突變體的突變位點和核苷酸變異情況。(b) 突變位點測序結(jié)果。(c-d) 野生型B73、3個B73 zmr1 EMS突變體(c)、2個突變體雜交植株和CQ01(d)的葉鞘中花青素積累的情況。(e) 通過對玉米原生質(zhì)體的瞬時表達分析ZmR1的亞細(xì)胞定位。

 

玉米zmr1 EMS突變體的等位基因檢測表明，葉鞘中的花青素色素沉著也受到ZmR1的控制。

圖4：玉米自交系B73的葉鞘和葉片中花青素的積累和ZmR1的表達，以及在B104中過表達ZmR1^B73后，葉中脈花青素積累增加

(a-b) B73和CQ01在葉鞘(a)和中脈(b)中的花青素積累。(c) B73生長30天后葉鞘中花青素的含量。(d)在生長30天的B73、CQ01和B73 zmr1 EMS突變體的葉鞘(靠近地面)、葉片和中脈中ZmR1的表達水平。(e)通過轉(zhuǎn)錄組分析鑒定生長30天的CQ01和B73葉中脈中ZmR1的FPKM值。(f) 生長30天的野生型B104和過表達ZmR1^B73的轉(zhuǎn)基因B104中花青素色素沉著的比較。(g-h) 過表達ZmR1^B73的轉(zhuǎn)基因B104和過表達ZmR1^CQ01的轉(zhuǎn)基因B104在生長30天時花青素色素沉著的比較。

 

ZmR1^B73等位基因調(diào)控花青素在近地葉鞘中積累，而在葉片中脈沒有積累。ZmR1^B73在中脈的mRNA表達水平較低，因而沒有花青素積累。過表達ZmR1^B73可以促進花青素在中脈的積累。

圖5：ZmR1^ZN3的功能驗證和功能分子標(biāo)記物的開發(fā)

(a) 花青素不在ZN3的葉鞘和中脈積累。(b) 生長30天的ZN3和CQ01的葉片、中脈和葉鞘中ZmR1的表達量比較。(c) 通過zmr1 EMS突變體等位基因測試驗證ZmR1^ZN3的功能。(d) ZN3和CQ01的序列比對顯示，在ZN3中缺失了ZmR1的第5個外顯子。(e) ZmR1可編碼三個保守結(jié)構(gòu)域，其中bHLH-MYCN結(jié)構(gòu)域由第5個外顯子編碼。(f) CQ01、ZN3和京紫糯219 (ZN3×CQ01)中分子標(biāo)記的擴增片段大小。CQ01為315 bp，ZN3為272 bp，京紫糯219為272 bp和315 bp。(g) 玉米自交系WMR的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與觀察到的表型一致。利用所開發(fā)的分子標(biāo)記，對432個田間玉米自交系進行了鑒定。WMR的擴增片段為272 bp。表型分析顯示，WMR的葉鞘和中脈缺乏花青素的積累。

 

對ZN3和CQ01的序列比較顯示，在ZN3中缺失了ZmR1的第5個外顯子，導(dǎo)致ZmR1^ZN3等位基因功能被破壞，因而在中脈和葉鞘中沒有花青素積累。

圖6：DAP-seq鑒定的ZmR1靶基因和RNA-seq鑒定的差異表達基因(DEGs)富集的代謝途徑

(a)ZmR1結(jié)合的置信度高的兩種motifs,“GATCAATGGCCA”和“GAGGWGTMBGWG”的motifs E值分別是 4.6e-311和1.3e-268。(b) 由DAP-seq鑒定的ZmR1的靶基因富集的前20個代謝途徑。(c) RNA-seq分析CQ01和B73的中脈，鑒定了DEGs富集的前20個代謝途徑。(d) RNA-seq分析野生型和過表達ZmR1^CQ01的京724的葉片，鑒定了DEGs富集的前20個代謝途徑。

 

DNA親和純化測序(DAP-seq)結(jié)果顯示，ZmR1^CQ01靶向了1010個基因，其中包括花青素合成途徑中的Bz2。RNA-seq分析顯示，ZmR1^CQ01靶向的55個基因的表達水平顯著改變，其中類黃酮和苯丙素生物合成途徑中關(guān)鍵酶的基因表達顯著上調(diào)。隨后，又開發(fā)了ZmR1功能分子標(biāo)記物。以上結(jié)果揭示了轉(zhuǎn)錄調(diào)控和序列變異對ZmR1功能的影響，并在全基因組水平上鑒定了ZmR1^CQ01的靶基因。

圖7：過表達ZmR1^CQ01玉米京724的應(yīng)用

(a) 過表達ZmR1^CQ01京724植株由綠色變?yōu)樽仙��?b)過表達ZmR1^CQ01京724的紫色玉米將白酒變?yōu)榧t色。(c) 過表達ZmR1^CQ01京724和京92雜交得到的田間玉米雜交種京科968植株是紫色的。

 

本文小結(jié)

本研究在玉米自交系CQ01的葉中脈中克隆了新的ZmR1等位基因。通過利用玉米EMS突變體、過表達ZmR1基因、分析序列差異、組織特異性表達分析、啟動子甲基化水平分析、轉(zhuǎn)錄組和DAP-seq結(jié)果，揭示了ZmR1在多種組織中對花青素分布的影響及其分子調(diào)控機制。

通過分子育種策略，可以產(chǎn)生高花青素含量的玉米品系。過表達ZmR1^CQ01，獲得了一個花青素含量高的紫色玉米雜交種京科968。本研究開發(fā)的新R等位基因ZmR1^CQ01及其功能分子標(biāo)記，可通過分子標(biāo)記輔助育種用于高花青素含量玉米新品種的遺傳改良和分子設(shè)計育種。

 

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