圖1 腫瘤微環(huán)境中免疫和基質(zhì)細(xì)胞群的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)

2. Ig 和 B 細(xì)胞相關(guān)基因在 TLS中的顯著富集促使研究關(guān)注 B 細(xì)胞
通過(guò)對(duì)腫瘤區(qū)域和TLS區(qū)域的差異分析顯示，免疫細(xì)胞的基因表達(dá)和成纖維細(xì)胞基因表達(dá)組成了TLS區(qū)域的主要表達(dá)特征，Ig 和 B 細(xì)胞相關(guān)基因在 TLS 中的顯著富集促使研究關(guān)注 B 細(xì)胞。PC 相關(guān)基因 MZB1 的表達(dá)在 TLS 中高，而在冷凍切片腫瘤的腫瘤區(qū)域中總體低。由于 PC 的主要功能是產(chǎn)生抗體，于是分析了免疫球蛋白基因的空間表達(dá)。最終證實(shí)了成纖維細(xì)胞與 CXCL12、MZB1 與成纖維細(xì)胞以及 MZB1與 CXCL12 在距 TLS 一定距離處的共定位�？偨Y(jié)來(lái)說(shuō)，在 TLS+ 腫瘤中，表達(dá)IGHG1 和 IGHA1的 PC 存在于 TLS 附近，并且可能隨成纖維細(xì)胞一起在腫瘤內(nèi)遷移。

3. 空間B細(xì)胞受體（BCR）分析可識(shí)別原位超突變和克隆選擇
TLS 中 B 細(xì)胞成熟亞型和 PC 的共定位暗示了原位 B 細(xì)胞適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生。在此過(guò)程中，B 細(xì)胞會(huì)突變其 B細(xì)胞受體 (BCR) 序列，并選擇和擴(kuò)增最親和的克隆。所以作者研究了 BCR 的核苷酸序列。因?yàn)閂isium冰凍切片空間技術(shù)原理是基于芯片中不同spot點(diǎn)位上Bracode的RNA測(cè)序，這使得作者能夠查詢?cè)�始轉(zhuǎn)錄物并進(jìn)行空間BCR分析。作者結(jié)合bulk RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TLS具有大量單一的輕鏈克隆型，突變的V基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較少，多數(shù)突變序列轉(zhuǎn)錄本位于TLS遠(yuǎn)端腫瘤區(qū)域。
 

圖2 空間BCR剖析識(shí)別腫瘤區(qū)突變和克隆擴(kuò)增和傳播

4. TLS的漿細(xì)胞沿著成纖維細(xì)胞軌跡擴(kuò)散
為了分析腫瘤內(nèi) PCs 和成纖維細(xì)胞的位置以及原位 CXCL12 的表達(dá)，作者利用多重免疫標(biāo)記（IF），在遠(yuǎn)離 TLS 的地方發(fā)現(xiàn)PC 沿著成纖維細(xì)胞軌道排列，嵌入在密集的 COL1+ CXCL12+ 成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中，從而證明它們?cè)谀[瘤床中的遷移。數(shù)據(jù)分析了 Ig 和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的共表達(dá)，以及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物和 CXCL12 的共表達(dá)，并驗(yàn)證了PC 在 TLS 內(nèi)的位置以及空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定的成纖維細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞 (FRC) 在空間上的位置。值得注意的是，在被 MUM1+ IgG+成纖維細(xì)胞軌道包圍的腫瘤巢中檢測(cè)到與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的 IgG。
 

圖3  TLS+ 腫瘤中 PC 與成纖維細(xì)胞和 IgG 腫瘤染色的共定位

5. TLS and Ig-producing PCs 與結(jié)合到凋亡腫瘤細(xì)胞的 IgG 抗體和對(duì)免疫治療的反應(yīng)相關(guān)
為了進(jìn)一步研究 TLS、腫瘤內(nèi)PC和Ig染色之間的聯(lián)系，首先分析了TLS成熟度。作者研究了 103 個(gè)腫瘤中 TLS 的存在與 PC 密度之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)含有 CD23+ FDC 網(wǎng)絡(luò)、BCL6+ 細(xì)胞和 PNAd+ HEV 的 TLS 與  MUM1+IgG+ PC 和 MUM1+IgA+ PC 密度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。后面又進(jìn)一步研究了 57 個(gè) TLS+ 樣本上 TLS 成熟度標(biāo)記與 MUM1+IgG+ 和  MUM1+IgA+ PCs 密度的相關(guān)性。

作者為了揭示腫瘤結(jié)合IgG抗體的功能，分析腫瘤細(xì)胞凋亡特征，結(jié)果顯示在IgG+腫瘤細(xì)胞＞60%的樣本中， Caspase 3活化的腫瘤細(xì)胞密度顯著升高。CD68+巨噬細(xì)胞與IgG+/cleaved caspase 3+腫瘤細(xì)胞距離更近。
 

圖4  與未成熟或沒(méi)有TLS的腫瘤相比，有TLS腫瘤的IgG+增加

總結(jié)
腫瘤的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）會(huì)影響癌癥免疫治療的效果。文章采用10x Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法對(duì)冰凍切片和FFPE切片進(jìn)行測(cè)序，鑒定腎細(xì)胞癌三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)特征，以及漿細(xì)胞傳播途徑與腫瘤細(xì)胞Caspase3活化和免疫抑制劑治療應(yīng)答的關(guān)系，揭示了前人未發(fā)現(xiàn)的在癌組織中B細(xì)胞對(duì)治療和預(yù)后的顯著意義，為未來(lái)腎細(xì)胞癌治療提供了思路。

參考文獻(xiàn)：
Meylan M, Petitprez F, Becht E, et al. Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer[J]. Immunity. 2022 Mar 8;55(3):527-541.
 

伯豪生物FFPE樣本時(shí)空組學(xué)解決方案一經(jīng)推出即得到客戶的廣泛關(guān)注，尤其是基于Visium CytAssist的空間轉(zhuǎn)錄組解決方案，以其便捷的操作和強(qiáng)大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，成為當(dāng)下FFPE樣本空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的熱門之選。

Visium CytAssist FFPE空間多組學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1.樣本兼容性高
FFPE空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)不再局限于石蠟塊，預(yù)貼片、預(yù)H&E染色的組織切片都可以通過(guò)Visium CytAssist系統(tǒng)將分析物從載玻片轉(zhuǎn)移到Visium玻片的捕獲區(qū)域。

2.捕獲面積大
Visium CytAssist能夠同時(shí)兼容6.5mm*6.5mm和11mm*11mm樣本。

3.質(zhì)控要求低
Visium CytAssist對(duì)樣本的DV200要求僅為30%，允許檢測(cè)更多長(zhǎng)期保存的高度降解的樣本。

4.基因檢出率高
Visium CytAssist使用10x Genomics全新設(shè)計(jì)的捕獲探針，除少部分高表達(dá)基因外，90%以上基因設(shè)計(jì)了3個(gè)探針對(duì)，基因檢出率及特異性更高。