第一題    貼壁和懸浮肝細(xì)胞使用的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？在具體實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該如何選擇呢？

答：肝細(xì)胞被分離后，可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞在最開始的4~6h內(nèi)細(xì)胞色素P450酶的活性最為和體內(nèi)一致，隨時間的延長而迅速下降，故懸浮肝細(xì)胞一般用于代謝穩(wěn)定性研究或代謝物譜研究。貼壁培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞有足夠的時間從損傷中恢復(fù)過來，保持了正常肝細(xì)胞的生物學(xué)特征及代謝活性，一般用于酶誘導(dǎo)研究、藥物細(xì)胞毒性研究、慢代謝藥物的代謝穩(wěn)定性或產(chǎn)物推斷研究。

第二題    貼壁原代肝細(xì)胞復(fù)蘇之后可以存活多久，如果肝細(xì)胞復(fù)蘇后不做貼壁培養(yǎng)可以維持多久？

答：

（1）貼壁原代肝細(xì)胞一般用于酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞復(fù)蘇后使用鋪板培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞至適宜濃度后使用膠原包被板進(jìn)行培養(yǎng)，一般在4~6小時內(nèi)細(xì)胞可進(jìn)行貼壁。細(xì)胞貼壁后，更換維持培養(yǎng)基繼續(xù)維持18h，以保證細(xì)胞狀態(tài)能最大程度恢復(fù)。接下來，即可開展酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行代謝活性和mRNA誘導(dǎo)水平的檢測。從整個周期來看，肝細(xì)胞貼壁后可以維持6~7天狀態(tài)，且隨時間延長細(xì)胞貼壁狀態(tài)變差，細(xì)胞會出現(xiàn)脫落懸浮現(xiàn)象。

（2）如果貼壁肝細(xì)胞不進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，我們驗(yàn)證過在4~6小時內(nèi)是可以維持在較好的狀態(tài)，更長時間的驗(yàn)證我們還暫時未開展。

第三題    關(guān)于貼壁肝細(xì)胞，會進(jìn)行哪些酶的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)？誘導(dǎo)效果如何？

答：我們的原代肝細(xì)胞均會使用指導(dǎo)原則推薦的陽性誘導(dǎo)劑對CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4三種酶的誘導(dǎo)效果進(jìn)行評估，且酶誘導(dǎo)結(jié)果符合要求才會進(jìn)行銷售�！端幬锵嗷プ饔弥笇�(dǎo)原則》明確規(guī)定研究在研藥物是否為代謝酶的誘導(dǎo)劑應(yīng)評估其是否會誘導(dǎo)主要的 CYP 同工酶 CYP1A2、 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19 或 CYP3A4。研究初期， 可只評估 CYP1A2，CYP2B6 和 CYP3A4。

第四題    酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)為什么選擇三個供體肝細(xì)胞？

答：根據(jù)《藥物相互作用指導(dǎo)原則》介紹，至少采用三個供體，每個供體的誘導(dǎo)結(jié)果應(yīng)單獨(dú)評估。如果至少一個供體的結(jié)果超過了預(yù)定的閾值，則在研藥物可能具有誘導(dǎo)作用，需進(jìn)行后續(xù)評估。

第五題    酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，若其中一個供體有1A2的誘導(dǎo)作用，其他兩個供體沒有，需要重復(fù)驗(yàn)證，需要怎么驗(yàn)證？

答：如需進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，可以通過增加供體數(shù)、重復(fù)實(shí)驗(yàn)等多種方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行確證。評估在研藥物對代謝酶潛在誘導(dǎo)作用的方法主要有以下三種：倍數(shù)變化方法、相關(guān)性方法、基礎(chǔ)動力學(xué)模型等，具體可參考《藥物相互作用指導(dǎo)原則》。

第六題    為什么只關(guān)注 CYP酶的誘導(dǎo)，而不關(guān)注二相酶如UGT的誘導(dǎo)？

答：只關(guān)注CYP酶的誘導(dǎo)是因?yàn)閷�CYP酶的誘導(dǎo)機(jī)制已經(jīng)研究的較為清楚，而沒有要求對UGT酶的誘導(dǎo)進(jìn)行研究是由于目前對其機(jī)制還不是很清楚，并不是說它不會被誘導(dǎo)。指導(dǎo)原則中也有說到，對于轉(zhuǎn)運(yùn)體以及 II 相代謝酶的誘導(dǎo)劑或者抑制劑還沒有標(biāo)準(zhǔn)化的分類系統(tǒng)。

第七題    3個供體是不是相當(dāng)于做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，為了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)有意義？

答：選擇三個供體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了使結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，更重要的也是為了評估個體間的差異，如果至少一個供體的結(jié)果超過了預(yù)定的閾值，則在研藥物可能具有誘導(dǎo)作用，需進(jìn)行后續(xù)評估。

第八題    酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞活性測定選什么方法合適？中性紅法會不會影響到后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄過程？

答：為保證酶活性檢測不會影響到后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄過程，通常在檢測方法和試劑的選擇上需要非常謹(jǐn)慎，通常大家都會選擇CCK-8或cell-Titer進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。目前，也有關(guān)于使用中性紅染料對肝細(xì)胞進(jìn)行活率檢測的報(bào)導(dǎo)，具體可參照下文。
第九題    酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)使用的原代肝細(xì)胞需使用哪些試劑和耗材？

答：酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)需要用到膠原包被板和四種配套的培養(yǎng)基，分別為：復(fù)蘇培養(yǎng)基，用于細(xì)胞復(fù)蘇過程；貼壁培養(yǎng)基，用于肝細(xì)胞初始貼壁；維持培養(yǎng)基，用于細(xì)胞狀態(tài)的恢復(fù)和后續(xù)誘導(dǎo)；孵育培養(yǎng)基，用于誘導(dǎo)后酶活性的測定。

第十題    酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的過程是什么？可使用同一塊板嗎？

答：體外肝細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)基本流程：

①使用復(fù)蘇培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇；

②使用鋪板培養(yǎng)基基將細(xì)胞進(jìn)行懸浮調(diào)整細(xì)胞密度后進(jìn)行細(xì)胞鋪板（膠原包被板）；

③鋪板4-6小時后細(xì)胞貼壁，更換維持培養(yǎng)基進(jìn)行換液維持18小時。

④維持后細(xì)胞恢復(fù)最好狀態(tài)開始誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，一般周期為2~3天。

⑤誘導(dǎo)結(jié)束后使用孵育培養(yǎng)進(jìn)行藥物代謝測定。另外，測定藥物誘導(dǎo)活性、活力測定、mRNA表達(dá)水平等測定使用同一塊板。需要注意的是，肝細(xì)胞貼壁培養(yǎng)要使用推薦的培養(yǎng)基，如使用維持培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞貼壁，維持培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分不足以維持細(xì)胞貼壁所需營養(yǎng)，則達(dá)不到預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

十一題    懸浮原代肝細(xì)胞可以培養(yǎng)多久？有沒有測試過其它Buffer的維持效果，如HBSS？

答：懸浮原代肝細(xì)胞復(fù)蘇后，我們會使用自研的孵育培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞維持，一般情況細(xì)胞可懸浮維持4-6小時，且隨著時間延長細(xì)胞會逐漸死亡。目前，我們還未測試過其它Buffer對細(xì)胞的維持效果，如HBSS。

十二題    藥物體外研究中最常使用的系統(tǒng)是肝微粒體，肝微粒體也包含了藥物代謝相關(guān)的主要CYP酶、UGT酶等，那么為什么還要選擇肝細(xì)胞呢？

答：微粒體在常規(guī)藥物代謝研究中應(yīng)用廣泛，如代謝途徑研究，酶抑制研究等，但是與原代肝細(xì)胞相比，微粒體卻有其自身劣勢：

（1）微粒體內(nèi)所含酶直接暴露，藥物或其代謝產(chǎn)物與代謝酶之間有現(xiàn)成的反應(yīng)通路，而不能反映體內(nèi)的情況，而且微粒體需要輔助因子參與才可進(jìn)行藥物代謝反應(yīng)；

（2）肝細(xì)胞胞質(zhì)中還存在部分肝微粒體缺失的代謝酶，如醛氧化酶（AO）、黃嘌呤氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等；

（3）微粒體中富含細(xì)胞色素P450酶和UGT酶，因此與其他酶之間不存在競爭性，這會導(dǎo)致藥物在微粒體中比在完整的細(xì)胞體系內(nèi)表現(xiàn)出更高的生物轉(zhuǎn)化率。然而，原代肝細(xì)胞卻體現(xiàn)出了其優(yōu)勢，例如藥物擴(kuò)散、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝的過程是基于整體細(xì)胞水平的，而且原代肝細(xì)胞培養(yǎng)后可維持?jǐn)?shù)天的活性，這提高了評價藥物代謝酶上調(diào)或下調(diào)的可行性等。

十三題    在肝細(xì)胞代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中陽性化合物質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)是多少呢？

答：目前，還沒有明確的文件規(guī)定陽性化合物半衰期和清除率的接受范圍，并且每個公司選擇的陽性化合物也可能不同，大家可分析自己公司的歷史數(shù)據(jù)，形成自己內(nèi)部的接受標(biāo)準(zhǔn)。本公司原代肝細(xì)胞產(chǎn)品也會選擇大家使用頻率最高的陽性化合物，對其半衰期和清除率進(jìn)行測定，并將其展現(xiàn)在我們的產(chǎn)品COA中，供大家挑選。

十四題    本公司能否提供除猴、犬、大鼠、小鼠等常見種屬之外的其它種屬肝細(xì)胞定制服務(wù)？

答：除常規(guī)種屬的原代肝細(xì)胞外，本公司還可提供特定種屬、特定周齡等的定制服務(wù)，具體可聯(lián)系商務(wù)團(tuán)隊(duì)，我們也會根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)需求推薦最適肝細(xì)胞選擇。

十五題    是不是因?yàn)槭褂玫呐囵B(yǎng)基的不同，肝細(xì)胞既能當(dāng)作懸浮細(xì)胞使用，又能當(dāng)成貼壁細(xì)胞使用呢？

答：大部分來自實(shí)體組織器官的細(xì)胞都會貼壁，但不是所有的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下都會貼壁。細(xì)胞貼壁與否首先會與細(xì)胞本身狀態(tài)有關(guān)；同時貼壁細(xì)胞也需要特定培養(yǎng)基及一些特殊的促細(xì)胞附著物質(zhì)（如鼠尾膠原、如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、血清擴(kuò)展因子等）可能參加細(xì)胞的貼附過程）等。也就是說，貼壁細(xì)胞我們可以作為懸浮細(xì)胞使用，但懸浮細(xì)胞不一定可用于貼壁使用。

十六題    代謝穩(wěn)定性研究中微粒體和肝細(xì)胞該如何選擇？是不是只需要選擇其中一個就可滿足要求？

答：在代謝穩(wěn)定性研究中，選肝微粒體還是選肝細(xì)胞，主要還是要看化合物的代謝特性，誰代謝速率高選誰。一般情況下，優(yōu)先選用肝微粒體，尤其是在化合物分子水溶性較強(qiáng)、一相代謝為主要代謝途徑（尤其是經(jīng)由CYP）等情況下，肝微粒體為最優(yōu)選擇。當(dāng)有證據(jù)顯示二相代謝為主要途徑、水解作用為主要代謝途徑、肝微粒體中非特異性蛋白結(jié)合很高、肝微粒體中代謝不明顯的時候，可使用肝細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通常情況下，選擇一個代謝系統(tǒng)即可滿足需求，若各方面條件允許，兩個系統(tǒng)同時選擇肯定是最好的。

十七題    有機(jī)溶劑的加入對肝細(xì)胞有什么影響？

答：孵育體系中有機(jī)溶劑的含量要控制在1%以內(nèi)。孵育體系中發(fā)揮代謝作用的組分是酶，而酶的本質(zhì)是蛋白，有機(jī)溶劑加入過多，會導(dǎo)致酶變性，活性降低或喪失，故孵育體系中要控制有機(jī)溶劑的加入量。

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