本期遺傳學(xué)與整合組學(xué)課題組為大家?guī)��?lái)的是2016年5月發(fā)表在Nature genetics 的‘Pancreatic cancer risk variant in LINC00673 creates a miR-1231 binding site and interferes with PTPN11 degradation’一文，關(guān)于長(zhǎng)鏈非編碼RNA-LINC00673中的一個(gè)胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)變異在疾病易感性中的相關(guān)研究。

研究背景

近年來(lái)發(fā)表了許多全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），確定了近6500個(gè)與疾病或性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)。然而，只有7％的基因位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)，而93％位于非編碼區(qū)。蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的突變通常是非常有害或致命的，因此癌癥發(fā)展之前這類(lèi)突變的攜帶者可能不會(huì)存活；然而，調(diào)節(jié)區(qū)域的突變能以細(xì)胞類(lèi)型或組織特異性方式引起基因表達(dá)的細(xì)微變化，這可能會(huì)導(dǎo)致載體對(duì)癌癥的易感性。lincRNAs是長(zhǎng)度超過(guò)200nt的基因間非編碼RNA，為人類(lèi)非編碼轉(zhuǎn)錄組中最大的亞類(lèi)，許多GWAS鑒定的基因位點(diǎn)位于編碼lincRNA的區(qū)域，這表明lincRNA遺傳變異可能在癌癥等疾病易感性中起重要作用。

  簡(jiǎn)  介

全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)作為一種高通量的研究方法,近年來(lái)已幫助生物醫(yī)學(xué)研究者們發(fā)現(xiàn)了一些與胰腺癌易感性相關(guān)的基因及遺傳位點(diǎn),然而影響胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的遺傳易感因素仍未被完全闡明。

本篇報(bào)道作者從這一點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)行了一系列數(shù)據(jù)分析：利用中國(guó)人群胰腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行GWAS分析，鑒定新的與胰腺癌易感性相關(guān)的基因及SNP（單核苷酸的多態(tài)性/單個(gè)堿基上的變異），最終篩到46個(gè)有價(jià)值的SNP。其中一個(gè)SNP：LINC00673外顯子4上的rs237位點(diǎn)(鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)換為腺嘌呤)與PDAC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，作者對(duì)其具體作用進(jìn)行了深入的研究。

研究結(jié)果

圖A是顯著易感基因座內(nèi)關(guān)聯(lián)結(jié)果和重組率的區(qū)域曲線圖，通過(guò)歸屬分析對(duì)以rs237為中心的2-Mb區(qū)域進(jìn)行了精細(xì)定位，發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP處于完全連鎖不平衡，2個(gè)SNP處于強(qiáng)連鎖不平衡。之后在rs237上進(jìn)行條件作用后，發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域幾乎不存在第二個(gè)易感等位基因。B圖生存曲線結(jié)果顯示：rs237基因型與生存率無(wú)明顯相關(guān)性�？傊�就是他們鑒定到linc 673中rs237的突變是PDAC易感因素。

A圖細(xì)胞及B圖組織qPCR結(jié)果都顯示：673在癌組織中表達(dá)降低。C圖分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，D-E分析其他癌癥類(lèi)型（食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)、肝細(xì)胞癌(HCC)）結(jié)果也都顯示在癌組織中673低表達(dá)。F圖TCGA數(shù)據(jù)分析顯示不同癌癥類(lèi)型中其表達(dá)水平存在一定差異。G-H qPCR和TCGA生存曲線結(jié)果都證明：673表達(dá)與PDAC生存率無(wú)相關(guān)性�？傊�前面2組生信分析結(jié)果表明：LINC00673中rs237的突變與PDAC易感性相關(guān)而與生存率無(wú)關(guān)，在癌組織中673水平降低。

許多證據(jù)表明miRNAs能夠與lincRNAs相互作用，調(diào)節(jié)lincRNA水平，作者推測(cè)673的SNP可能通過(guò)構(gòu)建或破壞某些miRNAs的結(jié)合位點(diǎn)來(lái)影響其表達(dá)水平。附圖A-B通過(guò)軟件分析發(fā)現(xiàn)rs237上的鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)換為腺嘌呤的突變會(huì)改變673的局部折疊結(jié)構(gòu)和自由能，附圖C圖顯示這種突變可能為miR-1231構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)。接著A圖熒光素酶報(bào)告分析實(shí)驗(yàn)顯示：當(dāng)加入miR-1231時(shí)，rs237[A]等位基因構(gòu)建體熒光素酶活性顯著降低，且隨著miR-1231濃度增加這種降低作用更明顯。B圖顯示當(dāng)加入miR-1231抑制劑后，附圖D顯示盡管miR-1231在這2種PDAC細(xì)胞系中仍有結(jié)構(gòu)性表達(dá)，但miR-1231和rs237[A]之間的特異性互作被完全挽救。C圖瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-1231后，qPCR測(cè)A、G這2種673的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：miR-1231只降低了673[A]的表達(dá)水平，說(shuō)明673[A]是miR-1231的靶標(biāo)。D圖qPCR評(píng)估了rs237基因型對(duì)PDAC癌旁組織中673水平的影響，結(jié)果顯示GG基因型個(gè)體的673水平顯著高于GA或AA基因型個(gè)體。E圖顯示miR-1231的水平在不同基因型個(gè)體中表達(dá)相近，說(shuō)明673的這種基因型特異性差異與miR-1231水平無(wú)關(guān)。附圖E-G進(jìn)一步分析了不同rs237基因型樣本中673和miR-1231水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在AA或GA基因型樣本中miR-1231水平與673水平呈負(fù)相關(guān)，而在GG基因型樣本中則不相關(guān)。附圖H測(cè)了在2種PDAC細(xì)胞中673和miR-1231表達(dá)水平比較類(lèi)似。總之這組實(shí)驗(yàn)證明：673突變體[A]是miR-1231的靶標(biāo)，可以與miR-1231結(jié)合從而降低673表達(dá)水平。

接下來(lái)表型實(shí)驗(yàn)：A-D圖CCK8法、E-F圖細(xì)胞周期分布、G-H克隆形成實(shí)驗(yàn)3種方法一致證明：過(guò)表達(dá)673時(shí)PDAC細(xì)胞增殖減弱，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，而敲除673后PDAC細(xì)胞增殖增加。附圖B流式測(cè)凋亡結(jié)果顯示673對(duì)PDAC細(xì)胞凋亡沒(méi)有顯著影響，附圖C-E結(jié)果顯示它對(duì)PDAC細(xì)胞遷移侵襲也沒(méi)顯著影響。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證明673抑制腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)。附圖還對(duì)永生化胰管上皮細(xì)胞系進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)，同樣發(fā)現(xiàn)673過(guò)表達(dá)顯著抑制了細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，但不影響集落形成和遷移侵襲等表型�？傊�這組實(shí)驗(yàn)證明：673是一種抗腫瘤RNA可以抑制細(xì)胞增殖。

接下來(lái)探索與673互作的蛋白，圖A RNA-pulldown及圖B找到673-蛋白復(fù)合物，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物中含有多種蛋白質(zhì)，其中含量最豐富的是PTPN11。圖C選了含量最豐富的前5個(gè)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果只檢測(cè)到了PTPN11。D-E 圖RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣顯示PTPN11抗體沉淀復(fù)合物中673富集，這幾個(gè)實(shí)驗(yàn)均表明PTPN11可能是673的關(guān)鍵靶蛋白。F圖構(gòu)建673的截短體，G圖構(gòu)建PTPN11截短體，最終找到了2者的互作區(qū)域：673  5’端1-448nt區(qū)與PTPN11  SH2-2結(jié)構(gòu)域互作。H圖顯示敲低和過(guò)表達(dá)673時(shí)PTPN11  mRNA水平不變，但是i圖顯示蛋白水平發(fā)生變化，過(guò)表達(dá)673G時(shí)PTPN11表達(dá)降低，敲除673時(shí)PTPN11表達(dá)增加，這也就說(shuō)明影響是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，J實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮處理，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)673G 使得PTPN11半衰期縮短。K圖蛋白酶體抑制劑MG132處理后，由673過(guò)表達(dá)造成的PTPN11的減少作用被逆轉(zhuǎn)。這2個(gè)實(shí)驗(yàn)表明泛素-蛋白酶體途徑可能在673介導(dǎo)PTPN11降解中起關(guān)鍵作用。L-m和附圖A-B圖WB結(jié)果顯示：在過(guò)度表達(dá)673G的細(xì)胞中，PTPN11的泛素化顯著增加，在敲除673細(xì)胞中，泛素化顯著降低。也就是說(shuō)：673與PTPN11互作，通過(guò)泛素化促進(jìn)了PTPN11的降解。

在進(jìn)一步研究673調(diào)節(jié)PTPN11泛素化的機(jī)制中，作者發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)與PTPN11相互作用的蛋白，其中包括已知的伴侶蛋白GAB2GRB2相關(guān)結(jié)合蛋白2亞型B以及PRPF19 mRNA預(yù)處理因子19，它是一種含U-box的E3泛素連接酶，可與其特定底物形成泛素化復(fù)合物。A-B圖分別用RNA-pulldown和RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了673與PTPN11結(jié)合，PTPN11與PRPF19結(jié)合，3者具有相關(guān)性。附圖C-D顯示673水平變化不會(huì)影響PRPF19表達(dá)變化，但673水平變化能影響PTPN11與PRPF19的互作，過(guò)表達(dá)673G促進(jìn)PTPN11與PRPF19互作。所以就基本可以推測(cè)PTPN11是PRPF19的底物，E-F圖通過(guò)敲除PRPF19，證明了敲除PRPF19后PTPN11蛋白水平增加，這是由于PTPN11泛素化減少所致。G圖構(gòu)建PTPN11截短體找到了它與PRPF19互作的結(jié)構(gòu)域是SH2-2�？傊�這組實(shí)驗(yàn)共同證明：673G可能作為一個(gè)介質(zhì)，強(qiáng)化PRPF19-PTPN11的互作，從而促進(jìn)PRPF19介導(dǎo)的泛素化和PTPN11的降解。

前面已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-1231特異性結(jié)合673[A]，而不是673[G]，所以作者推測(cè)673對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用可能與這個(gè)特異性有關(guān)。A-D圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：在miR-1231存在的情況下，過(guò)表達(dá)673[A]的細(xì)胞增殖速度更快，G0/G1阻滯更少。E圖顯示：在存在miR-1231時(shí)過(guò)表達(dá)673[A]的細(xì)胞中PTPN11泛素化顯著降低。F圖檢測(cè)rs237位點(diǎn)3種基因型PDAC癌旁組織中的PTPN11蛋白水平，結(jié)果顯示：GG基因型個(gè)體的PTPN11水平最低，AA個(gè)體PTPN11水平最高�？傊�這組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：miR-1231特異性的與673突變體A結(jié)合，抑制PTPN11的泛素化和降解，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。

接著作者研究673水平變化對(duì)PTPN11下游信號(hào)傳導(dǎo)的影響，上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)673對(duì)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)有影響，所以作者將研究重點(diǎn)放在參與細(xì)胞周期進(jìn)展的SRC-ERK通路。A圖在過(guò)表達(dá)673G的細(xì)胞中SRC和ERK1/2蛋白總量沒(méi)有顯著差異，但是磷酸化ERK水平降低，SRC激活位點(diǎn)(416)的酪氨酸殘基被低磷酸化，而SRC C末端抑制位點(diǎn)(529)的酪氨酸殘基被過(guò)度磷酸化，且SRC-ERK信號(hào)下游基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平也均發(fā)生了變化，其中包括MYC、cyclin A和cyclin D下降，p27上升，并且這種由673過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的SRC-ERK信號(hào)和PDAC細(xì)胞增殖抑制的作用能被PTPN11的過(guò)表達(dá)所挽救。B圖結(jié)果與A圖剛好相反。STAT1是已知的PTPN11下游分子，C圖結(jié)果顯示673[G]的過(guò)表達(dá)增加了總的STAT1和磷酸化STAT1的水平，同時(shí)也增加了STAT1依賴的干擾素反應(yīng)基因的mRNA水平（紫色條帶），而這種促進(jìn)作用同樣可被PTPN11所抑制。D圖敲低673[G]結(jié)果與C圖相反。

E-F圖通過(guò)敲除PTPN11發(fā)現(xiàn)得到了與673[G]過(guò)表達(dá)一樣的效果，表明673的作用是由PTPN11介導(dǎo)的。G圖分析了74例臨床胰腺組織中673水平與SRC-ERK下游基因、STAT1依賴干擾素反應(yīng)基因mRNA水平的相關(guān)性，總之這些結(jié)果顯示：673的表達(dá)水平與SRC-ERK下游促癌基因成負(fù)相關(guān)，與抑癌基因成正相關(guān)且激活STAT1信號(hào)通路。

總結(jié)與展望

綜上所述，本文作者通過(guò)GWAS分析發(fā)現(xiàn)了673與PDAC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。673是一種抗腫瘤RNA，能夠增強(qiáng)PTPN11與PRPF19的相互作用，通過(guò)泛素化促進(jìn)PTPN11降解，從而抑制具有促癌活性的SRC/ERK信號(hào)通路的活化，同時(shí)還可以激活依賴STAT1的抗腫瘤信號(hào)通路，這兩者均能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并防止腫瘤發(fā)生。而當(dāng)673上的rs237位點(diǎn)G突變?yōu)锳，miR-1231可以靶向這個(gè)突變體，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中游離的673水平降低，從而減弱了它的抗腫瘤作用而導(dǎo)致癌癥易感性。