摘要
細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和免疫系統(tǒng)反應(yīng)至關(guān)重要，在疾病診斷和治療方面具有新的作用 ^{1, 2}。許多關(guān)鍵細(xì)胞因子，如白介素 6 (IL-6) 和白介素 1 β (IL-1 β)，血清濃度范圍從飛摩爾 (fM) 到納摩爾 (nM) ^3,4。由于 Elisa 實(shí)驗(yàn)10²-10⁴動(dòng)態(tài)范圍限制，細(xì)胞因子10⁶ 濃度動(dòng)態(tài)范圍難用傳統(tǒng) ELISA 技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估⁵。 INNOPSYS 的InnoScan 710-IR 掃描儀近紅外檢測(cè)和Nirmidas Biotech pGOLD 芯片的金屬增強(qiáng)熒光 (MEF) ，能夠定量檢測(cè)10 ⁶ 濃度動(dòng)態(tài)范圍的白細(xì)胞介素 1 β 。
 
 
介紹
 
細(xì)胞因子在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用，是人體免疫系統(tǒng)狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)。細(xì)胞因子檢測(cè)可以幫助診斷一系列疾病，包括心血管疾病⁶和呼吸疾病⁷。細(xì)胞因子是小分子蛋白（大小為 5-20 kDa），表達(dá)濃度從亞 pg/ml⁸ 到數(shù)百 ng/ml³。目前廣泛使用的檢測(cè)技術(shù)，包括 ELISA 和微球技術(shù)，檢測(cè)下限為 ~1 pg/ml，難檢測(cè)低濃度細(xì)胞因子。同樣，大多數(shù) ELISA 和其他測(cè)定技術(shù)傾向于在可見光區(qū)域檢測(cè)信號(hào)，因生物樣品呈現(xiàn)高內(nèi)源性自發(fā)熒光，限制了其靈敏度。血清和血漿中的一些細(xì)胞因子缺乏可靠量化影響其用作診斷性生物標(biāo)志物。

一般檢測(cè)儀器有兩方面的局限：首先，檢測(cè)儀器缺乏低背景所需的波長(zhǎng)，其次，對(duì)于低濃度生物標(biāo)志物的檢測(cè)不夠靈敏。INNOPSYS 的InnoScan 710-IR 掃描儀，具有10⁶動(dòng)態(tài)范圍，且能以670nm 和 785 nm掃描紅和近紅外 (NIR) 熒光信號(hào)。在這個(gè)熒光區(qū)域，內(nèi)源性自發(fā)熒光低，能提高檢測(cè)靈敏度。同樣重要的是，近年來(lái)能夠進(jìn)行生物分子偶聯(lián)的高量子產(chǎn)率近紅外熒光染料的數(shù)量也在增加。
 
Nirmidas Biotech, Inc. 將一種稱為 pGOLD 的等離子芯片技術(shù)商業(yè)化，該技術(shù)可將熒光信號(hào)放大 100 倍，從而能夠檢測(cè)更低濃度的生物標(biāo)志物 ^8,10-13
 
pGOLD 芯片與傳統(tǒng)蛋白芯片使用相同的實(shí)驗(yàn)方案，具有與標(biāo)準(zhǔn)載玻片芯片相同的形狀，能在紅和近紅外波長(zhǎng)最大限度地放大熒光信號(hào)。在本應(yīng)用案例中，InnoScan 710-IR 的近紅外掃描功能與 pGOLD 芯片信號(hào)放大效應(yīng)相結(jié)合，能檢測(cè)亞 pg/ml 濃度的 IL-1 β 。
 
實(shí)驗(yàn)部分
 
功能化的 pGOLD 芯片被分為 8個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域有三個(gè)固定了抗 IL-1 β 單克隆抗體的點(diǎn)，作為捕獲抗體，使用含白蛋白的磷酸鹽溶液(PBS)作為緩沖液。將 pGOLD 芯片的每個(gè)區(qū)域與不同濃度的人 IL-1 β 細(xì)胞因子在 緩沖液中孵育，濃度范圍從 1 fM 到 1nM 以及一個(gè)空白對(duì)照。洗滌后，每個(gè)區(qū)域與 偶聯(lián)了IR800熒光分子抗 IL-1 β 多克隆抗體進(jìn)行孵育。 孵育后，洗滌去除游離、未結(jié)合的抗體。使用InnoScan 710-IR儀器進(jìn)行掃描，激發(fā)波長(zhǎng)為785nm。由于樣品點(diǎn)直徑大，PMT 增益設(shè)置為 20，掃描分辨率設(shè)置為 20 µm/pixel； InnoScan 710-IR 能夠?qū)崿F(xiàn)低至 3 µm /pixel的分辨率。
 
 
結(jié)果與討論
pGOLD 芯片金屬增強(qiáng)熒光（MEF）有效放大熒光信號(hào)。 MEF 作為一種現(xiàn)象已經(jīng)存在幾十年，近年通過斯坦福大學(xué)的研究進(jìn)行了優(yōu)化^8,10-¹³，圖 2 數(shù)據(jù)顯示通過 pGOLD 芯片和InnoScan 710-IR
  圖 2：在頂部，通過 pGOLD 芯片和 Innoscan 710-IR 掃描儀檢測(cè)IL-1 β 。即使在 1 fM濃度 的 IL-1 β ，也可以看到三個(gè)信號(hào)點(diǎn)。在底部，平均熒光強(qiáng)度 (MFI) 相對(duì)于 IL-1 β 濃度以對(duì)數(shù)方式繪制。線性響應(yīng)范圍低于 0.1 pg/ml。

檢測(cè) IL-1 β細(xì)胞因子，可實(shí)現(xiàn)低至 1 fM 的信號(hào)檢測(cè)。如圖2所示，InnoScan 710-IR能檢測(cè)IR800熒光染料信號(hào)，在近紅外波長(zhǎng)檢測(cè)濃度低于 0.1 pg/ml 的細(xì)胞因子 IL-1 β ，同時(shí)具備大于10⁵ 動(dòng)態(tài)范圍。
 
 
參考文獻(xiàn)
 

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