1、前言

每種微生物基本都有各自的特異性表面抗原，使用單抗偶聯(lián)各種熒光素可方便檢測各種樣品中的微生物。樣品經(jīng)熒光染色（如SYBR Green I 或其他染色劑染色）后，可用CytosSense 測定微生物含量。(高通量：>200000cell ; 粒徑：0.1-700μm) ，目前可直接檢測大腸桿菌，嗜血桿菌、沙門氏菌、結(jié)核桿菌、銅綠假單胞菌、軍團桿菌等。在瑞士，F(xiàn)CM方法被列為標(biāo)準(zhǔn)細菌監(jiān)測方法。

常用核酸染料：
SYBR Green I ——滲透膜，檢測活細胞。
PI (碘化丙定) ——不滲透膜，只能通過破損的細胞膜，檢測死細胞。
當(dāng)然，也可以根據(jù)檢測目的選擇其他激光波長和熒光帶與目標(biāo)染料進行最佳匹配染色。

488nm激光器可激發(fā)多種熒光素
 
2、CytoSense 檢測微生物所需配置

2.1 激光檢測器配置：488nm激光器，綠/黃檢測熒光通道。

2.2 進樣系統(tǒng)設(shè)置：使用CytoSense 檢測細菌時我們建議在樣品泵中使用特殊的管道，以盡量減少染色細胞粘附在管道上，對其他操作沒有影響。即更換下圖配件：
 

2.3 鞘液設(shè)置：

A） 實驗室手動染色樣品

如果樣品制備中進行了細胞清洗，則直接上機檢測沒有影響；如果樣品沒有清洗，樣品含有游離染料，則有兩種選擇：

a）“正常使用循環(huán)鞘液”：為防止染料在鞘液中積聚，緩慢增加熒光通道中的背景信號，因此建議定期投加氯�？梢酝ㄟ^安裝加氯泵實現(xiàn)自動化，或者，我們可以安裝一個帶有流動開關(guān)的特殊過濾器（下圖），以從鞘液中去除染料。

b） 使用“非循環(huán)鞘液系統(tǒng)”：可將“受污染”的鞘液會立即從儀器中排出，無需再循環(huán)，本方案只需為鞘液提供足夠的清潔水。外置鞘液系統(tǒng)有利于保護管路和內(nèi)置的過濾系統(tǒng)，延長其使用壽命。濁度較高的樣品，藻濃度較高的樣品，也可以使用外置鞘液系統(tǒng)來運行儀器。

 

外置鞘液系統(tǒng)連接方式如下：（標(biāo)準(zhǔn)CytoSense即可，用戶可方便自行改裝）
 

非循環(huán)外置鞘液系統(tǒng)

 

B） 現(xiàn)場自動染色監(jiān)測

增加配件 “細菌染色模塊”，可以自動調(diào)節(jié)鞘液。同時 “染色模塊”，可以實現(xiàn)自動染色。適用于水中微生物我的在線自動監(jiān)測。

 

使用方法：與正常細胞檢測一樣，沖洗、啟動和分析操作是自動化的，所有程序都在軟件中編寫。熒光染料有時需要在瓶子空了之后重新填充，定期更換氯和過濾器-取決于使用情況等，可自動運行幾個月。
 

※ 對于已經(jīng)擁有CytoSense的最終用戶，不需要購買另一臺CytoSense，只需加配染色模塊，對現(xiàn)有CytoSense做微小調(diào)整，以適應(yīng)與染色模塊的耦合（如電子連接和安裝不同類型的樣品泵）。

3、應(yīng)用案例

3.1 上升流系統(tǒng)和人為活動對巴西沿海地區(qū)微生物多樣性的影響(巴西里約熱內(nèi)盧聯(lián)邦大學(xué))
 

細菌活性測定   利用CytoSense 測定細菌濃度，配置488nm，20mV固體藍色激光，側(cè)向散射（SWS，446/500nm）檢測器和紅色（葉綠素-a）熒光（FL1-669/725nm）；橙色/黃色（FL-2，601/651nm），綠色/黃色（FL-3，515/585nm）熒光檢測器。使0.92和10mm的黃綠色熒光小球作為內(nèi)標(biāo)，并使用Length，SWS和Average，OFL參數(shù)進行細菌計數(shù)現(xiàn)場測定。細菌樣本使用SYBER Green I 染色，通過側(cè)向散射SWS和橙色熒光信號進行鑒別。

3.2 CytoSense分析大容量沖擊采樣器采集的空氣中細菌(丹麥奧胡斯大學(xué))
 

空氣中細菌細胞的特性需要有效的收集、濃縮和分析技術(shù)，特別是要克服它們在室外環(huán)境中被稀釋的挑戰(zhàn)。建立了一種快速、可靠的空氣中細菌定量方法。為此，采用大容積沖擊取樣器從污水處理廠（WWTP）收集空氣中的細菌。用CytoSense測定細菌細胞密度，并與基于16srRNA基因的定量PCR（qPCR）數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果表明，該方法對室外環(huán)境中細菌密度的估計是可靠的，用CytoSense法進行分析比qPCR法更快、更靈敏。此外，不同的取樣條件下，CytoSense可提供有價值的細胞特征信息。
 

采用CytoSense對沖擊式氣體采樣器收集到的氣載細菌和參考菌株大腸桿菌進行計數(shù)和鑒定。配置488nm激光器，550nm的高靈敏度黃光發(fā)射傳感器。同時記錄每個粒子的脈沖形狀的信號可用于估計細胞體積，并將細胞定義為不同細胞類型的特定簇。分析粒子體積通過FWS的掃描脈沖圖或SWS的掃描脈沖圖估算。

 

3.3 絲狀菌生物過程中的孢子質(zhì)量在線監(jiān)測（維也納科技大學(xué)）
 

真菌生物過程中孢子接種物質(zhì)量的測定尤為重要，因為萌發(fā)孢子的數(shù)量會影響過程性能，進而影響產(chǎn)品效價。因此，需要確定孢子接種體中活孢子的濃度，以便將精確數(shù)量的活孢子接種到生物反應(yīng)器中。根據(jù)孢子接種體的不同，孢子需要不同的時間段膨脹、萌發(fā)，從而生長菌絲。本文提出的方法不僅可以取代菌落形成單元（CFU）測定法，而且可以在線監(jiān)測孢子的溶脹和萌發(fā)。
* 活菌染色熒光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙二鈉（PI）能夠區(qū)分代謝活性/活菌/FDA陽性孢子和非活菌孢子
 

3.4 高頻監(jiān)測水生生態(tài)系統(tǒng)中異氧微生物的原位特征及動態(tài)（地中海海洋研究所）
 

自動染色模塊（SM）安裝于CytoSense，可同時原位自動采樣、分析浮游植物和細菌。水樣在行船過程中持續(xù)泵入系統(tǒng)，SYBR Green I熒光染料通過小的染色容器逐滴加入樣品（V/V=1：10000），經(jīng)15min 染色反應(yīng)后自動泵入CytoSense。通過本次項目地中海海洋研究所展示了CytoSense 不僅可以檢測自發(fā)熒光的浮游植物，而且可檢測細菌、鞭毛蟲、纖毛蟲等微生物。經(jīng)過2 小時一次共七天的實驗，獲得了更多有效數(shù)據(jù)。

4、參考文獻

[1] Cury JC, Araujo FV, Coelho-Souza SA, et al. Microbial diversity of a Brazilian coastal region influenced by an upwelling system and anthropogenic activity. PLoS One, 2011, 6(1): e16553.

[2] Coelho-Souza SA, Araújo FV, Cury JC, et al. Bacterial and Archaeal Communities Variability Associated with Upwelling and Anthropogenic Pressures in the Protection Area of Arraial do Cabo (Cabo Frio region - RJ). An Acad Bras Cienc, 2015, 87(3): 1737-1750.

[3 L. Haraguchi, H. H. Jakobsen, N. Lundholm, J. Carstensen. Monitoring natural phytoplankton communities: a comparison between traditional methods and pulse-shape recording flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol., 2017, 80: 77-92.

[4] J. Jang, N. B. Hendriksen, H. H. Jakobsen, U. Gosewinkel. Application of Cytosense flow cytometer for the analysis of airborne bacteria collected by a high volume impingement sample. Journal of Microbiological Methods, 2018, 154 : 63–72.

[5] T. Silovic, G. Grégori, M. Dugenne, et al. A new automated flow cytometer for high frequency in situ characterisation of heterotrophic microorganisms and their dynamics in aquatic ecosystems. IMEKO International Conference on Metrology for The Sea, Naples, Italy, October 11-13, 2017.

[6] Ehgartner, D., Herwig, C., & Neutsch, L. At-line determination of spore inoculum quality in Penicillium chrysogenum bioprocesse. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 1-11.

[7] Ehgartner, D., Fricke, J., Schröder, A., & Herwig, C. (2016). At-line determination of spore germination of Penicilliumchrysogenumbioprocesses in complex media. Fungal Genetics and Biology, Manuskript in preparation.

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