隨著基因編輯技術(shù)的迭代更新和模型構(gòu)建費(fèi)用的降低，基因敲除（KO）小鼠使用已成為學(xué)者開展科研項(xiàng)目時(shí)的優(yōu)先選擇項(xiàng)。市售的成品敲除模型鼠種類繁多，在經(jīng)歷了相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的繁育等待后，拿到純合子敲除模型的小伙伴最后發(fā)現(xiàn)仍能檢測(cè)到敲除的目的蛋白表達(dá)�。�缺少這么重要的數(shù)據(jù)，下一步課題怎么開展？論文怎么發(fā)表？科研經(jīng)費(fèi)和時(shí)間都被浪費(fèi)掉了，真是賠了夫人又折兵啊。
 

濟(jì)世金編根據(jù)多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，幫助各位學(xué)者理清可能原因：

1、蛋白驗(yàn)證的影響因素：

1) 抗體的特異性：非特異性條帶是蛋白檢測(cè)中最常見的問題，使用高質(zhì)量、特異性強(qiáng)的抗體是獲得可靠結(jié)果的關(guān)鍵。針對(duì)這一問題，可以結(jié)合PCR的方法對(duì)敲除基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)未檢測(cè)到敲除基因mRNA表達(dá)的情況下，需要考慮更換另一家公司抗體進(jìn)行檢測(cè)目的蛋白。

2) 抗體的結(jié)合位點(diǎn)：移碼突變型的敲除可以表達(dá)出目的基因N端的部分肽段，如果所使用的抗體結(jié)合位點(diǎn)剛好在表達(dá)的殘留蛋白上是可能被檢測(cè)到的。所以在選擇抗體的時(shí)候盡可能選擇識(shí)別C端肽段的抗體。

2、基因敲除方式的影響因素：

市面上絕大多數(shù)的成品敲除模型采用的是移碼突變的構(gòu)建方式，這些模型只經(jīng)過了基因組DNA的PCR驗(yàn)證，表明移碼突變成功；但未進(jìn)行RT-PCR（mRNA表達(dá)）或WB（蛋白表達(dá)）的驗(yàn)證。移碼突變是指DNA鏈上插入或缺失1個(gè)、2個(gè)甚至多個(gè)堿基（非3個(gè)堿基或3的整數(shù)倍的堿基），導(dǎo)致在插入或缺失堿基部位以后的密碼子順序和組成發(fā)生相應(yīng)改變。這種構(gòu)建方式的弊端是：由于原來的密碼子移位，終止密碼子常常推后或提前出現(xiàn)，結(jié)果造成新合成的肽鏈延長(zhǎng)或縮短，容易出現(xiàn)截?cái)嗟鞍讱埩?/span>，對(duì)抗體的結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生干擾。

更要命的是，移碼突變的模型構(gòu)建方式有可能導(dǎo)致未知肽段或蛋白的生成。這使我們無法確認(rèn)利用這種敲除方式準(zhǔn)備的模型，其病理或功能上的表型是否是由目的基因功能缺失引起的，甚至?xí)�影響到整個(gè)研究的結(jié)果。

3、推薦的解決方案：

目的基因完全敲除的小鼠模型構(gòu)建方式

這種構(gòu)建方式是在受精卵胚胎中精準(zhǔn)地完全刪除或盡可能刪除最大片段的目的基因組序列。通過這種方式構(gòu)建的基因敲除小鼠，其目的基因無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，最大程度的避免了前面提到的移碼突變敲除方式所帶來的檢測(cè)問題及潛在的異常蛋白干擾風(fēng)險(xiǎn)，是目前基因敲除動(dòng)物制備的發(fā)展趨勢(shì)。

案例：Dcaf8基因完全敲除小鼠模型

        需要注意的是，由于特定基因的基因組區(qū)域可能包含其他必要信息，在選擇完全敲除這種模型構(gòu)建方式時(shí)需要有專業(yè)的技術(shù)人員對(duì)目的基因的功能和基因組序列進(jìn)行評(píng)估。