帕金森氏癥(PD)是一個在全球范圍內受到密切關注的疾病。迄今為止，在臨床常規(guī)中沒有可靠的生物標志物。在有神經癥狀的患者中例行收集腦脊液(CSF)，并且其應密切反映PD患者大腦的變化。在此研究中，研究者描述了一個可擴展和靈敏的基于質譜(MS)的蛋白質組學工作流程，用于腦脊液蛋白質組分析。從兩個（一共超過200人）獨立隊列中，他們的工作流程從最少的腦脊液量中重復量化了超過1700個蛋白質。機器學習篩選出了PD患者中OMD、CD44、VGF、PRL和MAN2B1的改變或與臨床評分顯著相關。他們還發(fā)現(xiàn)了在LRRK2 G2019S攜帶者中存在增強的神經炎癥的特征，顯示CTSS、PLD4和HLA蛋白水平升高。與研究者之前獲得的尿蛋白組的比較顯示PD相關的變化有很大的重疊，包括溶酶體蛋白，這為人們更好地理解PD的發(fā)病機制開辟了新的途徑。

 

01 文章詳情

文章題目：Proteome profiling of cerebrospinal fluid reveals biomarker candidates for Parkinson’s disease

中文題目：腦脊液蛋白質組分析揭示帕金森病的生物標志物候選者

發(fā)表時間：2022.06

期刊名稱：Cell Reports Medicine

影響因子：16.988

DOI：10.1016/j.xcrm.2022.100661

Graphical abstract

 

02 研究思路

腦脊液樣品的蛋白質組學特征

研究者分析了來自兩個獨立隊列共215個個體的腦脊液樣本，包括113名健康對照(HC)和102名PD患者（第一個隊列稱HBS隊列、第二個隊列稱LCC隊列）。研究者開發(fā)了一個基于MS的蛋白質組學工作流程，其使用數據獨立采集(DIA)策略對最少數量的腦脊液進行蛋白質組分析(圖1A)。研究者應用他們自己的工作流程，探究存在或不存在LRRK2中與疾病相關的G2019S突變的PD患者腦脊液中的蛋白質組變化。與群體特異性雜交文庫5418和3167個蛋白質進行匹配，分別得到了HBS和LCC人群的1493和1626個蛋白質，其中共有1300多個蛋白質(圖1B)。平均每個腦脊液樣本定量1357 (HBS)和1481 (LCC)蛋白組，其中超過70%的樣本定量1290 (HBS)和1440 (LCC)蛋白組(圖1C、1D)。量化的蛋白質強度跨越了四個數量級(圖1E和1F)。僅前10個最豐富的蛋白質就貢獻了腦脊液蛋白質組總信號的38%左右，說明了分析的挑戰(zhàn)(圖1E和1F)。

圖1 基于MS的兩個獨立腦脊液PD隊列的蛋白質組學分析

 

定量精度和樣品質量的評估

研究者為了評估研究中的定量精度，他們通過重復測量匯集的腦脊液樣本，研究了他們自動化工作流程的分析內部和分析間的變量。該分析顯示，具有13%板內和19%板間變異系數(CVs)的高技術重現(xiàn)性。大約1100人的檢測間和檢測內CV低于20%，1500人低于50%(圖1G)。研究對象之間的個體間生物學變異性要大得多，只有10%的蛋白質CV低于20%(圖1G)。這表明他們的檢測方法的技術變異性比生物學變異性小得多，這是成功發(fā)現(xiàn)CSF中PD特異性蛋白組特征和潛在生物標記物的一個重要前提條件。

不一致的樣本收集和處理可能導致系統(tǒng)性偏差，阻礙真正的生物標記物的發(fā)現(xiàn)。為了確保腦脊液蛋白的定量變化是由于疾病相關的病理改變，研究者根據先前建立的凝固相關蛋白、血小板和紅細胞的質量標記模型來評估所有樣本的質量，以確定在分析前處理中存在潛在問題的樣本 (圖2A和2B)。結果表明：紅細胞特異性標記的污染程度在樣本間有很高的變異性，可能是由于與血液穿刺相關的污染(圖2A及2B)。他們從HBS隊列中標記了14個樣本(8個PD, 6個HC)，從LCC隊列中標記了17個樣本(4個PD, 13個HC)的紅細胞污染，并將其從進一步分析中刪除(圖2C和2D)。共有182個受試者的蛋白質組符合質量標準并被用于統(tǒng)計分析。他們發(fā)現(xiàn)紅細胞計數和腦脊液中紅細胞特異性蛋白的數量之間沒有相關性(圖2E)。這解釋了為什么最初的高紅細胞計數不影響蛋白質組測量。

圖2 利用小分子抑制劑庫進行高通量篩選

 

腦脊液中PD相關的蛋白質組改變和基于機器學習的PD患者和對照組的分類

為了研究PD患者與對照組相比腦脊液蛋白質組的改變，研究者進行了ANCOVA分析。在5%的錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)下，與HBS對照組相比，在HBS隊列PD患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)了三種顯著調控蛋白(CPM、OMD和RFNG)；與LCC對照組相比，在LCC隊列PD患者中發(fā)現(xiàn)了一種(PRCP)(圖3A)。PD患者的骨調節(jié)蛋白（OMD）和細胞表面標記蛋白（CD44）蛋白水平均顯著升高 (圖3B-3E)。隨后研究者進行了GO富集分析。結果表明：與對照組相比，PD樣品中升高的蛋白質在溶酶體相關功能上富集，進一步支持溶酶體的新作用 (圖3F)。由于在兩組人群中都存在(但數量很少)普遍改變的蛋白質，研究者將HBS和LCC結合并使用機器學習 (ML)探究PD患者和對照組區(qū)別。在每次訓練迭代中選擇35個最具識別力的用于訓練模型的蛋白質，分類器根據它們的特征重要性對它們進行排序(圖3G)。其中催乳素(基因名:PRL)是50次訓練迭代中最重要的特征。當使用這些特征來訓練XGBoost時（一個基于集成樹的模型），結合研究者的交叉驗證方案，ROC曲線的平均AUC為0.72±0.08。敏感性(PD患者的正確分類率)和特異性(PD陰性患者的正確分類率)分別為67%和66%(圖3H)。綜上所述，研究者的腦脊液蛋白質組數據與ML算法結合后，對疾病狀態(tài)進行了分類，更重要的是，確定了幾個有前途的PD相關蛋白，為未來的研究開辟了有趣的線索。

圖3 腦脊液蛋白質組的PD相關改變和基于ML的PD狀態(tài)分類

 

致病性LRRK2 G2019S突變對CSF蛋白質組的影響

鑒于LCC隊列中攜帶LRRK2 G2019S突變的受試者數量可觀，研究者探索了LRRK2突變狀態(tài)是否會改變CSF蛋白質組。研究者再次應用以性別、樣本采集年齡、研究中心和PD狀態(tài)為混雜因素的ANCOVAR。FDR在5%時，突變顯著改變了HLADRA、HLA-DRB1、HLA-DPA1、CTSS、PLD4、TKT、ITGB2、PRDX3、ITIH5、CNDP1和FAH蛋白的豐度(圖4A)。根據樣本中識別出的多肽可以區(qū)分出HLA-DRB1的兩種形式，它們都在LRRK2 G0219S攜帶者中顯著富集。此外，F(xiàn)DR為5%的Student 's t檢驗證實了突變攜帶者HLA-DRA、HLA-DRB1和HLA-DPA1的上調(圖4A和4B)。在LCC隊列中，這些HLA蛋白以及PLD4和CTSS的水平在PD患者中顯著升高(圖4B-4D)。GO富集分析顯示：與野生型(WT)等位基因攜帶者相比，LRRK2 G2019S攜帶者腦脊液蛋白組中升高的蛋白質在與免疫和炎癥反應相關的條目中得到了富集，進一步支持了增強的炎癥反應與PD密切相關(圖4E)。研究者最近發(fā)現(xiàn)，在兩個獨立隊列中，組織蛋白酶家族的多個成員，包括組織蛋白酶A、B、C、D、H、L、O、S和Z的水平在LRRK2 G2019S攜帶者的尿液中顯著增加。他們也在腦脊液中檢測到這些組織蛋白酶，但與僅在尿液中檢測到的組織蛋白酶S (CTSS)相比，其顯著受突變狀態(tài)的影響(圖4F)。

圖4 致病性LRRK2 G2019S突變對CSF蛋白質組的影響

 

腦脊液和尿液蛋白質組的整合

研究者在其之前的研究中分析了來自兩個獨立的橫向隊列(哥倫比亞和LCC)的235個尿液樣本，包括兩種類型的對照組、健康人群、LRRK2 G2019S攜帶者、LRRK2 G2019S突變和無LRRK2 G2019S突變的PD患者，共量化了2365個尿蛋白[2]。隨后研究者整合了尿液和腦脊液蛋白質組來確定共調節(jié)的蛋白。結果顯示：超過1000個蛋白質重疊，對應于兩種生物液體中所有已識別蛋白質的36%(圖5A)。匹配共同的蛋白質豐度揭示了兩種生物液體之間的明確相關性(圖5 B)。兩種液體中最豐富的蛋白包括ALB，PTGDS，ORM1，SERPINA1，B2M，以及幾種載脂蛋白和免疫球蛋白(圖5B，右上方的標記蛋白)。將PD患者腦脊液(HBS和LCC)和尿液(哥倫比亞隊列)中所有常見蛋白的ANCOVA q值與對照組進行比較，發(fā)現(xiàn)有幾種蛋白在兩種液體中均被調節(jié)(圖5D和5E)。其中骨調節(jié)素(OMD)的水平在PD患者的尿液中也顯著升高 (圖5F)。接下來，研究者將LCC隊列的CSF樣本和哥倫比亞組或LCC隊列的尿液樣本中定量的所有常見蛋白的LRRK2 G2019S與LRRK2 WT進行整合(圖5G和5H)。結果顯示，組織蛋白酶S在兩個矩陣中都以LRRK2狀態(tài)依賴的方式被調節(jié)(圖5G和5H)。與LRRK2 WT攜帶者相比，LRRK2 G2019S攜帶者腦脊液中的組織蛋白酶S水平更高，哥倫比亞組和LCC組的平均倍數變化分別為1.31 (p值為0.0619)和1.65 (p值為0.0001574)(圖5I)。

圖5 腦脊液和尿液蛋白質組的整合

 

腦脊液蛋白質組譜與臨床評分的相關性表明疾病的嚴重程度

研究者接下來調查HBS隊列中任何蛋白質水平的變化是否與帕金森病統(tǒng)一分級量表(UPDRS)評估的PD病理嚴重程度相關(圖6)。他們發(fā)現(xiàn)27種蛋白質與特發(fā)性PD患者的UPDRS評分顯著相關(圖6 A)。在PD患者中呈正相關最高的蛋白包括CHST6，MIF，LYVE1，EFNA1和ADM；呈負相關性最高的蛋白包括POMGNT1，TMEM132A，ADAM22，PAM和ST6GAL2(圖6 A)。有趣的是，PD患者與對照組相比，這些蛋白質都沒有明顯改變。此外，研究者將腦脊液蛋白的相關性得分與他們之前在尿液中得到的相關得分進行了比較。UPDRS III評分的Pearson系數比較(尿液中唯一可用的評分)顯示10種蛋白質(APOF、MAN2B2、LYVE1、APLP1、ALDOA、IGF2、SUSD5、CD99、S100A7和VGF)在兩個矩陣中系數都高于0.4或低于-0.4(圖6B)。其中，VGF與兩組數據中的UPDRS III評分均呈顯著負相關(圖6 C)。總的來說，這項分析表明，PD患者的疾病進展(通過運動功能評估)影響腦脊液和尿液中一組類似的蛋白質。

圖6 特發(fā)性PD (iPD)患者腦脊液和尿蛋白組與UPDRS評分的相關性

 

03 主要結論

研究者應用了一個高度可復制和可擴展的基于MS的蛋白質組學工作流程來對PD患者的腦脊液進行蛋白質組分析。相比于對照組，在PD患者中可以顯著觀察到蛋白質組的變化，并確定了LRRK2 G2019S攜帶者特異性的生物標志物。當然研究者還需要分析更大的患者隊列進行進一步的研究，去發(fā)現(xiàn)更多潛在的生物標志物。接下來研究者需要開發(fā)臨床和靶向分析來驗證生物標志物，然后在臨床常規(guī)中使用一種測試，以實現(xiàn)早期疾病檢測和患者分層。

 

參考文獻：

[1] Karayel O, Virreira Winter S, Padmanabhan S, Kuras YI, Vu DT, Tuncali I, Merchant K, Wills AM, Scherzer CR, Mann M. Proteome profiling of cerebrospinal fluid reveals biomarker candidates for Parkinson's disease. Cell Rep Med. 2022 Jun 21;3(6):100661.

[2] Virreira Winter S, Karayel O, Strauss MT, Padmanabhan S, Surface M, Merchant K, Alcalay RN, Mann M. Urinary proteome profiling for stratifying patients with familial Parkinson's disease. EMBO Mol Med. 2021 Mar 5;13(3):e13257.