編者按

癲癇（復(fù)發(fā)性無因癲癇）十分常見，但目前對于其發(fā)病機制尚不清楚�？贵@厥藥物是目前的一線治療方法，但是三分之一的患者患有藥物難治性癲癇(DRE)。目前只有切除性癲癇手術(shù)，即切除部分引起癲癇的腦組織，才能提供治愈方法。因此，深入研究癲癇的發(fā)病機制是十分重要的。研究者做出假設(shè)，不適當(dāng)?shù)拇傺讬C制可能是人類患者的難治性癲癇（對抗癲癇藥物無反應(yīng)性）的發(fā)病機制。通過CITE-seq，揭示手術(shù)切除的癲癇病變組織的免疫轉(zhuǎn)錄組。本研究揭示了一種促炎微環(huán)境，包括小膠質(zhì)細胞的廣泛激活和其他促炎免疫細胞的浸潤。通過配體-受體(LR)相互作用分析提供了小膠質(zhì)細胞和T細胞之間的潛在浸潤機制和直接的物理相互作用的證據(jù)，從而驗證了上述發(fā)現(xiàn)�？傊�，這些數(shù)據(jù)提供了對癲癇組織中的免疫微環(huán)境的理解，并且可能為DRE和一些其他神經(jīng)炎癥疾病的介入治療提供指導(dǎo)。

 

文章詳情

文章題目：Single-cell transcriptomics and surface epitope detection in human brain epileptic lesions identifies pro-inflammatory signaling.

中文題目：人腦癲癇病灶中的單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表面蛋白檢測確定促炎癥的信號傳遞

發(fā)表時間：2022.07

期刊名稱：Nature neuroscience

影響因子：28.771

實驗平臺：10X Chromium 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

DOI：10.1038/s41593-022-01095-5.

 

研究內(nèi)容

1. 定義癲癇患者大腦中的駐留性和浸潤性的免疫細胞

為了確定影響癲癇發(fā)生的免疫機制，研究者對手術(shù)切除的癲癇病灶組織進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組和表面蛋白測序（CITE-seq）。首先從6個體患者的11個腦組織樣本中分離免疫細胞，并使用10x Genomics單細胞平臺進行測序，分析了85780個細胞和22968個基因數(shù)據(jù)。對基因表達水平進行聚類和t-SNE分析，共鑒定26個聚類。接下來進一步利用表面蛋白標(biāo)記物鑒定集群，結(jié)果顯示：簇0-7、9-12和14（共13個簇）被鑒定為小膠質(zhì)細胞（CD45lo），簇8、15-17、19和21（共6個簇）被鑒定為浸潤性免疫細胞（CD45hi）。通過單細胞測序分群，能夠同時識別大腦中的小膠質(zhì)細胞、免疫細胞和非免疫細胞，并能夠定量譜系特異性表面蛋白和基因表達水平。

Fig.1 DRE患者腦組織中的小膠質(zhì)細胞和浸潤性免疫細胞

 

2. 小膠質(zhì)細胞在DRE組織中表現(xiàn)出促炎表型

接下來，為了研究在DRE組織中的小膠質(zhì)細胞中是否可以發(fā)現(xiàn)炎癥通路的激活，研究者分別通過單核細胞測序（snRNA-seq）和scRNA-seq，對來自非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組和ASD患者的腦組織、以及來自于在癲癇手術(shù)中被病理評估為正常的切除的人類腦皮層組織mRNA的表達進行分析。結(jié)果顯示，在snRNA-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)中，來自非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組和ASD患者的小膠質(zhì)細胞都表達了特征性的小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物。來自DRE患者的小膠質(zhì)細胞顯示了促炎細胞因子和趨化因子基因的表達。然而，在snRNA-seq數(shù)據(jù)集中，來自非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組或ASD的小膠質(zhì)細胞并沒有顯示出這些促炎細胞因子和趨化因子的表達。通過比較DRE患者、非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組和ASD個體的小膠質(zhì)細胞基因表達，可以發(fā)現(xiàn)DRE小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)明顯升高。研究者通過免疫組化（IHC）成像分析對大腦微環(huán)境進行成像，進一步驗證了上述發(fā)現(xiàn)。

Fig.2 DRE患者、非神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組和ASD患者腦組織中促炎基因和小膠質(zhì)細胞特異性基因的表達

 

3. NVUs與免疫細胞之間的功能性配體-受體相互作用

為了研究來自DRE-M的NVUs與浸潤性白細胞之間的相互作用，研究者創(chuàng)建了一個NVUs內(nèi)的細胞與浸潤性免疫細胞之間的配體-受體（LR）相互作用的細胞網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)節(jié)點之間共有809個LR相互作用，其中有265對獨特的LR對（有206對出現(xiàn)在NVU和CAM集群之間）。接下來，研究者進一步探討了這種關(guān)系機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有三個CD4+節(jié)點均富集了IL7R的表達，編碼其同源受體的TSLP在NVUs中富集；TNF、CCL5和TGFB1在免疫細胞簇中表達，而它們的同源受體TNFRSF21、ACKR1和ACRL1在NVUs中表達，并使用CellChat R包進一步驗證了它們之間的互作結(jié)果�？傊�，LR相互作用組網(wǎng)絡(luò)定義了免疫細胞浸潤偏向DRE-M的機制。

Fig.3 癲癇人腦免疫細胞及其與NVU細胞的相互作用

 

為了進一步驗證上述發(fā)現(xiàn)，研究者建立了TLE小鼠模型進行單細胞測序。RNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，TLE小鼠中有1600個基因顯著改變，有122個LR基因在人類DRE中富集。在這些LR基因中，許多關(guān)鍵的LR對，包括趨化因子和細胞因子及其受體基因在TLE小鼠大腦中上調(diào)�？傊�，動物癲癇模型進一步的證實了人類單細胞測序的數(shù)據(jù)。

Fig.4 LR基因在TLE癲癇小鼠模型中顯著調(diào)節(jié)

 

4. 小膠質(zhì)細胞和T細胞之間的直接相互作用

Cluster 3表達CD3、CD11b和HLA-DR表面蛋白，說明該群是T細胞和小膠質(zhì)細胞和/或巨噬細胞的雙態(tài)簇。接下來研究者使用主要譜系蛋白表達標(biāo)記對Cluster 3進行重新聚類，進一步分析了這些雙態(tài)簇的成分。結(jié)果共獲得6個cluster，包括CD8+ T細胞群（Cluster 0）、CD4+ T細胞群（Cluster 1）、B細胞群（Cluster 4）、NK細胞（Cluster 2）和巨噬細胞簇（Cluster 5）。研究者使用物理相互作用細胞測序（PICs）（PIC-seq），尋找由于物理相互作用而被調(diào)節(jié)的基因，隨后將差異表達的基因與來自兩種細胞類型的小膠質(zhì)細胞和T細胞的預(yù)期貢獻進行比較。結(jié)果顯示，在物理相互作用后，促炎和細胞毒性功能相互增強。最后，研究者使用IHC和流式細胞術(shù)驗證了T細胞-小膠質(zhì)細胞雙重免疫復(fù)合物，結(jié)合PIC-seq和IHC分析，發(fā)現(xiàn)與未直接接觸的小膠質(zhì)細胞和T細胞相比，小膠質(zhì)細胞免疫細胞雙細胞明顯顯示出增加的促炎功能。

Fig.5 難治性癲癇患者腦組織中小膠質(zhì)細胞與浸潤性T細胞的直接相互作用

 

主要結(jié)論

本研究通過單細胞轉(zhuǎn)錄組和表面蛋白測序（CITE-seq），揭示手術(shù)切除的癲癇病變組織的的促炎微環(huán)境，包括小膠質(zhì)細胞的廣泛激活和其他促炎免疫細胞的浸潤，同時還提供了小膠質(zhì)細胞和T細胞之間的潛在浸潤機制和直接的物理相互作用的證據(jù)，從而驗證了上述發(fā)現(xiàn)�？傊�，這些數(shù)據(jù)提供了對癲癇組織中的免疫微環(huán)境的理解，并且可能為DRE和一些其他神經(jīng)炎癥疾病的介入治療提供指導(dǎo)。

 

參考文獻：

Kumar P, Lim A, Hazirah SN, et al. Single-cell transcriptomics and surface epitope detection in human brain epileptic lesions identifies pro-inflammatory signaling. Nat Neurosci. 2022;25(7):956-966. doi:10.1038/s41593-022-01095-5