多組學(xué)分析揭示疤痕和再生傷口——愈合過(guò)程中不同的分子事件（二）

 

文章題目：Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing

中文題目：多組學(xué)分析揭示了疤痕和再生傷口愈合過(guò)程中不同的分子事件

見(jiàn)刊時(shí)間：2022.02

期刊名稱：Cell Stem Cell

影響因子：25.269

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：scRNA-seq (10X Genomics)、蛋白質(zhì)組學(xué)（TIMSTOF）

DOI：10.1016/j.stem.2021.12.011

 

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研究?jī)?nèi)容（接上文）

之前研究者做了多模式分析，但接下來(lái)他們是如何確定了Trps1在再生中的功能意義呢，請(qǐng)見(jiàn)如下研究?jī)?nèi)容：

4、傷口中纖維化和再生軌跡標(biāo)志物的分析

研究者之前的分析表明，空間定位——而不僅僅是細(xì)胞數(shù)量——可能決定了PBS和維替泊芬傷口中不同的表型，因此他們對(duì)Trps1 (Wnt通路調(diào)節(jié)因子)、YAP(機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào))和Dpp4 (En-1系瘢痕成纖維細(xì)胞；圖2M)進(jìn)行了IF分析。結(jié)果顯示，在PBS與替泊芬傷口中，Dpp4+細(xì)胞(EPFs)顯著增加，特別是在真皮深處(圖2M右)。與維替泊芬抑制機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)一致，YAP在PBS傷口中的表達(dá)高于維替泊芬傷口或UW皮膚(圖2M)。Trps1在對(duì)照組傷口中表達(dá)極低，但在維替泊芬傷口中大量表達(dá)，基于人工智能的成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中Trps1核定位定量顯示，維替泊芬傷口中有較高的核Trps1+成纖維細(xì)胞(圖2N)。盡管如之前所述，UW皮膚Trps1表達(dá)僅限于基底上皮和真皮乳頭 (圖2M，左)，但在維替泊芬創(chuàng)傷中，在再生HF周圍發(fā)現(xiàn)了高核Trps1+細(xì)胞簇(圖2M，下)。

PBS和維替泊芬治療的一個(gè)顯著區(qū)別是后者在30天內(nèi)出現(xiàn)再生HF；控制傷口形成裸露區(qū)域。研究者想知道他們的成纖維細(xì)胞軌跡分析是否可以揭示HF/腺體再生的主要調(diào)節(jié)因子。Trps1是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在再生臂中強(qiáng)烈富集(圖2F和3C)，是首選的候選因子。Trps1曾被報(bào)道為一種新的Wnt信號(hào)“主調(diào)控因子”，并且多項(xiàng)研究表明Trps1參與HF形態(tài)發(fā)生，Trps1活性異常與人類毛發(fā)過(guò)度生長(zhǎng)(多毛癥)有關(guān)，使其成為一種有前途的驅(qū)動(dòng)創(chuàng)面HF再生的候選者。研究者結(jié)論表明，Trps1+細(xì)胞在再生傷口中富集，并在新生HF周圍空間聚集(圖2M和2N)。據(jù)報(bào)道，Trps1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)共享的YAP/TEA結(jié)構(gòu)域(TEAD)基因組結(jié)合位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄上調(diào)節(jié)YAP信號(hào)。鑒于再生軌跡以機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)降低和Trps1升高為特征，他們推測(cè)Trps1可能是創(chuàng)面再生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

基于綜合多模態(tài)分析，研究者試圖驗(yàn)證不同傷口表型中關(guān)鍵基因的相關(guān)性。他們選擇了四種標(biāo)記基因來(lái)區(qū)分不同途徑(例如，機(jī)械激活和Wnt信號(hào))和纖維化或者再生臂：Ankrd1 (YAP靶基因)，Trps1 (Wnt調(diào)節(jié)因子)，Rspo1 (Wnt激動(dòng)劑)和Dpp4 (EPF譜系標(biāo)記；圖2C, 2F, 3B和3C)。分析結(jié)果顯示，這些基因共同分化了機(jī)械激活/促纖維化(Dpp4和Ankrd1)和再生(Rspo1和Trps1)通路。為了探測(cè)關(guān)鍵基因的空間分布，他們對(duì)Ankrd1、Dpp4、Trps1和Rspo1進(jìn)行了多重RNAscope原位雜交。在POD 14維替泊芬傷口中，在真皮表面發(fā)現(xiàn)含有Rspo1和Trps1 RNA顆粒的成纖維細(xì)胞聚集在內(nèi)陷上皮周圍，與新生HF一致(圖5A和圖5C下)。相比之下，POD 14 PBS創(chuàng)面中的Rspo1+和Trps1+細(xì)胞在真皮中隨機(jī)分散(圖5A和圖5C上)。POD 30是纖維化/再生創(chuàng)面表型差異最大的時(shí)間，PBS創(chuàng)面成纖維細(xì)胞有更多的Dpp4和Ankrd1，而維替泊芬創(chuàng)面有更多的Rspo1和Trps1 RNA顆粒，集中在再生HF周圍(圖5B和5D)。從數(shù)千個(gè)細(xì)胞中量化顆粒證實(shí)了這些趨勢(shì)(圖5E和5F)，支持了在YAP抑制的(低Ankrd1)傷口中ENF介導(dǎo)的愈合(低Dpp4)通過(guò)Wnt激活(高Trps1和Rspo1)產(chǎn)生HF再生的發(fā)現(xiàn)。

圖5. 瘢痕和再生過(guò)程中成纖維細(xì)胞的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

 

6、確定Trps1在再生中的功能意義

考慮到Trps1在Wnt信號(hào)、HF形態(tài)發(fā)生和YAP調(diào)節(jié)中的重要性，以及Trps1+成纖維細(xì)胞與HF再生的空間關(guān)系，他們?cè)噲D確定Trps1在創(chuàng)面再生中的功能。他們首先進(jìn)行了成纖維細(xì)胞特異性Trps1 OE，以評(píng)估Trps1是否足以在正常瘢痕條件下的傷口再生。我們開(kāi)發(fā)了慢病毒載體，編碼帶有蛋白水解T2A連接子的floxed mTrps1:EGFP轉(zhuǎn)基因基因(成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞是增強(qiáng)的綠色熒光蛋白[EGFP]+)，當(dāng)將其皮下注射到它莫西芬誘導(dǎo)的Col1a1-CreERT;Ai9小鼠(成纖維細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因)時(shí)，使成纖維細(xì)胞特異性Trps1 OE。為了針對(duì)不同的修復(fù)階段，它們?cè)谠缙?POD−3和7)都過(guò)表達(dá)Trps1，以研究其在早期過(guò)程中的作用，如炎癥、肉芽形成和早期ECM合成，以及晚期(POD 7和17)，在疤痕(PBS)傷口中，對(duì)后期過(guò)程如成纖維細(xì)胞遷移、ECM沉積和早期重塑。對(duì)照組創(chuàng)面(Trps1-OEC)注射FLEXon EGFP慢病毒。結(jié)果表明，Trps1-OEC創(chuàng)面形成疤痕，而Trps1-OEE和Trps1-OEL創(chuàng)面疤痕不太明顯，且能再生HF(圖6A)。組織學(xué)證實(shí)Trps1表達(dá)增加(圖6C)，并在Trps1- OEE和Trps1- OEL傷口中顯示少量再生附件結(jié)構(gòu)和更多UW樣ECM(圖6B, 6D，右和6E)；這些發(fā)現(xiàn)在定量上得到了證實(shí)，明顯更多的HF/腺體和明顯更高的(即更多的UW樣)ECM評(píng)分(圖6D)。與Trps1- OEE相比，Trps1- OEL傷口的再生作用更明顯，這表明Trps1的促再生作用可能在早期愈合時(shí)間點(diǎn)最大�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明Trps1 OE在一定程度上足以促進(jìn)傷口再生。

接下來(lái)，為了評(píng)估Trps1對(duì)維替泊芬誘導(dǎo)的傷口再生是否必要，他們開(kāi)發(fā)了miR30-mTrps1慢病毒載體，當(dāng)對(duì)小鼠皮下注射該載體時(shí)，使成纖維細(xì)胞特異性Trps1 KD(成纖維細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)EGFP)。他們?cè)谠缙跁r(shí)間點(diǎn)(POD−3/7;Trps1-KDE)和晚期時(shí)間點(diǎn)(POD 7/17;Trps1-KDL) 敲除了Trps1。結(jié)果顯示，Trps1-KDC傷口顯示毛發(fā)再生且無(wú)瘢痕，而Trps1-KDE和Trps1-KDL傷口形成無(wú)毛瘢痕(圖6F；IF證實(shí)Trps1表達(dá)下降，圖6H)。

組織學(xué)上，Trps1-KDE和Trps1-KDL傷口ECM再生完全消失，取而代之的是瘢痕ECM(圖6G, 6I右，6J)。有趣的是，僅在Trps1- KDL傷口中觀察到附件結(jié)構(gòu)的顯著丟失(圖6G右和6I)，這意味著在愈合后的維替泊芬誘導(dǎo)的附件再生(如HF)中特別需要Trps1�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明Trps1是傷口完全再生所必需的，在早期和晚期愈合中具有不同的作用。

綜上所述，研究者綜合多模式分析區(qū)分了兩種修復(fù)軌跡。第一種是EPF介導(dǎo)的(Dpp4+)，其特征是機(jī)械激活(高核YAP, Ankrd1+，Trps1−)，并導(dǎo)致疤痕ECM。第二種是ENF介導(dǎo)的(Dpp4−)，缺乏機(jī)械激活(低核YAP, Ankrd1−，Trps1+)，通過(guò)Wnt激活導(dǎo)致正常ECM和HF的再生。

圖6. 成纖維細(xì)胞靶向慢病毒Trps1過(guò)表達(dá)和敲除

 

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主要結(jié)論

此研究為利用細(xì)胞表面條形碼和多組學(xué)分析提供了一個(gè)框架，極大地提高了組織動(dòng)力學(xué)的分析，并提出了一種在ENF介導(dǎo)修復(fù)中驅(qū)動(dòng)再生的潛在機(jī)制。與YAP競(jìng)爭(zhēng)共享靶位點(diǎn)的Trps1與纖維化較少的轉(zhuǎn)錄軌跡相關(guān)，并在空間上與HF再生相關(guān)。他們的研究結(jié)果表明，Trps1和下游的Wnt信號(hào)也發(fā)生在疤痕傷口成纖維細(xì)胞中，但在沒(méi)有YAP抑制的情況下，表型上由YAP信號(hào)主導(dǎo)。這可能表明再生是一種“默認(rèn)的”修復(fù)途徑，被機(jī)械激活的纖維化趨勢(shì)所取代。

 

參考文獻(xiàn)

Mascharak S, Talbott HE, Januszyk M, Griffin M, Chen K, Davitt MF, Demeter J, Henn D, Bonham CA, Foster DS, Mooney N, Cheng R, Jackson PK, Wan DC, Gurtner GC, Longaker MT. Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing. Cell Stem Cell. 2022 Feb 3;29(2):315-327.e6. doi: 10.1016/j.stem.2021.12.011. Epub 2022 Jan 24. PMID: 35077667; PMCID: PMC8988390.